蛋白质组检测技术进展

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将样品在电泳前标记 Cy2 、Cy3 和 Cy5 这
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国外医学卫生学分册 2004 年 第 31 卷 第 1 期
1 传统的检测方法 传统的考马斯亮染技术由于其较低的成
本 、使用方便和与下游的蛋白质鉴定技术的 良好相容性得到了非常广泛的使用 。但其缺 点在于胶与胶之间的重复性差且由于胶本身 的差异而难以控制 。在改进的方法中 ,通过 应用胶体染色颗粒 ,胶本身可不被显著着色 。 其原理是通过在染色过程中形成胶体颗粒和 染料之间的平衡 ,染料进入胶内与蛋白质点 结合 ,胶体颗粒则被阻挡于胶外 ,因此使得胶 本身不着色 。通常传统的考马斯亮蓝染色和 胶体考马斯亮蓝染色能检测到 8~10 和 30~ 100ng 的蛋白[4] ,局限在于它的检测灵敏度和 线性动态范围比较小 。
荧光染色在定量的准确性 、灵敏度以及 蛋白质识别和鉴定的现代下游技术的相容性 等方面超越了传统的染色技术如考马斯亮蓝 染色 法 和 银 染 。SYPRO Red 、SPYRO Orange 和 SYPRO Tangerine 3 种 染 料 可 一 步 检 测 SDS2PAGFra Baidu bibliotek 胶上的蛋白质 ,只需 30~ 60min , 且无 脱 色 步 骤 , 可 检 测 到 4 ~ 8ng 量 的 蛋 白[8] 。但不足之处在于试剂价格较贵 。目前 以荧光染色和质谱为基础的方法学正为蛋白 质组的多元定量分析提供不可比拟的新的技 术支持 。
收稿日期 :2003208222 ;修回日期 :2003211221 基金项目 :国家自然科学基金重大研究计划 (90209006) 作者简介 :姜楠 (19792) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向 : 中药药理
学。
蛋白和难溶的膜蛋白及大分子量 、低丰度蛋 白也都不能被检测到 ,使得在其后的分析中 忽略了这些蛋白点[2] ;4) 一张胶上最多只能 检测到 3000 个左右的蛋白点 ,很多蛋白可能 共同移到了一个点上 ,造成了定量和质谱分 析的准确性降低 。双向电泳后对蛋白质的筛 选和定 量 分 析 也 一 直 没 有 理 想 的 技 术 和 方 法 ,主要原因在于双向电泳的重复性差 。例 如 ,在凝胶图像分析中 ,蛋白点的边界难以确 定 ,胶与胶之间的背景值和点的强度都需要 均化来消除胶之间的差异 ,而且匹配时也会 有很多难以避免的误差[3] 。而且由于双向电 泳技术越来越多地用于分离目的蛋白进行质 谱分析 ,所以人们希望得到与质谱技术相融 合的蛋白质显色技术 。所以 ,除了要求显色 方法的灵敏度 、线性和重复性要好 ,还要求它 能与现代的蛋白质组学分析技术衔接完好 。 目前常用于蛋白质检测的技术包括有机染料 染色 、银染 、放射同位素标记 、负染 、荧光染色 等方法 。两种新近出现的相差显示蛋白质组
2 相差显示蛋白质组学 蛋白质组学通常用于分析样品蛋白质之
间的差异 。传统方法是在不同的胶上分离不 同的样品 ,分别进行检测和定量 ,然后各个组 别的胶进行匹配 。目前有很多图象分析软 件 ,如 BIO2RAD 公司开发的 PDQuest , Amer2 sham Pharmacia Biotech 开发的 ImageMaster 2D Elite , Genomic Solutions 开发的 BioImage 2D In2 vestigator 等 。然而由于胶与胶之间的差异很 大 ,重复性不高 ,如何提高检测和定量的准确 性仍是一个很大的问题 。各实验室往往通过 将同一样品重复跑出多块胶后 ,用平均值进 行定量以消除实验误差 。但匹配的准确性也 往往很低 ,需要消耗大量时间和精力来进行 人工匹配 。差异凝胶电泳和 ICAT 方法通过 多元分析来得到蛋白质组方面更多的信息 , 它们的出现将大大提高胶与胶之间的重复性 和结果的可信性 。 211 差异凝胶电泳
费用于检测 、货存管理和实验人员的培训 。 还有很多文献报道了关于在 SDS2PAGE
胶上使用负染的方法 ,包括使用氯化钾 、氯化 铜 、氯化锌 、乙酸钴 、氯化镍和锌2咪唑等 。目 前 3 种最常用的负染方法是使用氯化钾 、氯 化铜和氯化锌 。其中 ,氯化铜的染色灵敏度 略高 ,氯化钾的灵敏度则远低于考马斯亮蓝 染色法 。氯化锌法是目前灵敏度最高的负染 方法[7] 。
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[21 ] Wattiez R ,et al. [J ] . Electrophoresis , 2000 , 21 (13) : 270322712.
[22 ] Sabounchi2Schutt F , et al. [J ] . Electrophoresis , 2001 ,22 : 185121860.
虽然从理论上来说 ,该方法非常诱人 ,但 DIGE 本身还有很多技术上的问题 。如 :1) 只 有当约 1 %~2 %的蛋白质的赖氨酸残基在 荧光标记时修饰 ,才可以维持被标记的蛋白 在电泳时的溶解性[9] ;2) 在 DIGE 染色中丢失 的蛋白质基本确定为样品中的低丰度蛋白 ; 3) 虽然经染色后在电荷上未发生变化 ,被染 料标记的蛋白质比未标记的蛋白质点向大分 子方向有轻微迁移 ,主要是由于荧光团的加 入 。这使得在标记的和未标记蛋白之间产生 95 %的误差 ,之后在质谱分析时产生更多的 复杂问题 。可通过再染色的方法以使割点的
蛋白质组 (proteome) 这一概念是由澳大 利亚学者 Wilkins 等[1] 于 1994 年提出 , 指的 是由一个细胞或一个组织的基因组所表达的 全部相应的蛋白质 。在蛋白质组学研究领域 主要使用双向凝胶电泳 (2D) 和质谱来进行 蛋白质的分离和鉴定 ,双相凝胶电泳目前使 用最为广泛 ,第一相为等电聚焦 ,根据蛋白质 等电点的不同进行分离 ,第二相为 SDS2聚丙 烯酰胺凝胶电泳 (SDS2PAGE) ,根据分子量的 不同进行分离 。通过该项技术可以得到关于 等电点 、分子量 、相对丰度 、蛋白质同功型 、修 饰 、亚细胞位置 、蛋白质相互作用等信息 。但 该技术仍有很多不足 ,如 :1) 操作步骤自动化 程度低 ;2) 重复性差 ;3) 等电点较大 (大于 9) 或较小 (小于 4) 的点不易得到分离 ,疏水的
放射性同位素标记方法常用3 H、14 C、35 S、 32 P、33 P 和125 I 等来进行标记 ,该方法大量用于 体内的代谢实验 。然而 ,近来用放射标记来 检测蛋白质合成速率的方法也受到了质疑 。 如在代谢实验中 ,混入放射物如35 S2蛋氨酸 , 在标准剂量和作用时间下 ,可引起 DNA 的断 裂 ,增加 P53 蛋白水平 ,改变细胞和细胞核的 形态使细胞周期停止或引起凋亡[6] 。虽然该 方法的灵敏度比较高 ,但使用放射性物质不 但危险而且成本很高 ,还需要很大一部分经
[28 ] von Bredow C , et al. [J ] . Eur Respir J , 2001 , 17 :7162722.
012 蛋白质组检测技术进展
姜 楠 ,霍海如 ,姜廷良 综述
(中国中医研究院中药研究所唐氏中药研究中心 ,北京 100700)
摘要 : “蛋白质组学”概念自 1994 年提出之后 ,其研究技术得到了突飞猛进的发展 ,主要采用的是双向凝胶 电泳 ,但该方法存在很多不足 ,尤其在蛋白质的检测手段和定量分析上还不尽如人意 。目前广泛使用的染色 技术是银染和考马斯亮蓝染色 ,荧光染色等更准确和灵敏的检测技术也为蛋白质组学技术提供了不可比拟 的技术支持 。差异凝胶电泳和同位素代码标记的出现 ,对以双向电泳为核心的传统方法提出了创新和改进 , 新产生的多元化的分析方法将大大加强目前双向凝胶电泳的应用能力 ,促进其解决更多的基础问题 。 关键词 :蛋白质组 ; 双向电泳 ; 检测技术 中图分类号 : R115 文献标识码 : A 文章编号 : 100121226 (2004) 0120055204
银染技术比考染灵敏度高 ,是通过将胶 浸泡于含银离子的溶液内 ,从胶面上洗掉非 紧密结合的金属离子 ,加入某些试剂使与胶 内蛋白结合的银离子形成金属银来显色 。该 方法可检测到纳克级的蛋白质 ,其线性动态 范围在 40 倍范围内 。但银染步骤非常复杂 , 繁多 ,胶与胶间的重复性较差 ,有报道差异可 达到 20 %[5] 。目前有些自动化的银染过程 将有可能减少这种差异 。银染时加入醛类作 为固定剂虽然可以提高检测灵敏度 ,但这样 将干扰 Edman 测序和质谱分析 。
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3 种荧光染料 ,然后将标记后的 3 种样品混 合 ,同时在一块胶上进行电泳 ,即为差异凝胶 电泳 (DIGE) [9 ,10] 。所得到的 2D 胶图像可使 用 3 种不同的激发Π发射过滤器得到不同颜 色荧光信号 ,根据这些信号的比例来判断样 品之间蛋白质的差异 ,这样可避免在匹配时 出现的误差 ,进行定量分析时也不依赖于胶 与胶之间的重复性 。用于标记的荧光基团在 化学结构上相似 ,分子量也基本相同 ,都带有 正电荷 ,所以在与赖氨酸残基反应时 ,保证了 所有的样品可以移至相同的位置 。该方法的 灵敏度可与银染和 SYPRO Ruby 相媲美 ,可 检测到 100~200pg 的蛋白质 ,线形动态范围 在 5 倍左右[11] 。已有很多文献证明该方法 的灵敏性和重复性 ,如用该方法研究苯甲酸 对大肠 杆 菌 的 抑 制 作 用 和 食 道 癌 的 特 征 蛋 白 。该方法也提高了定量上的准确性 。由于 实验方 法 本 身 造 成 的 蛋 白 质 斑 点 强 度 的 差 异 ,比如样品在进入胶条时会有一些样品损 失 ,但在同一块差异凝胶电泳胶上就不会出 现这样的差异 。目前出现了一种改良了的 DIGE 技术使其更好的进行定量分析 ,该技术 将 Cy2 作为用 Cy3 、Cy5 标记的蛋白质内标 , 用以比较数据库中各个胶之间的蛋白质的量 的差异 。DIGE 可在同一次检测中通过分析 单一胶上的相互覆盖的信息来得到蛋白质的 信息 ,可以同时在一块胶上在相同电泳条件 下分离 2~3 个样品 ,大大减少了一个实验需 要的胶的总数[12] 。
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国外医学卫生学分册 2004 年 第 31 卷 第 1 期
学方法 (differential display proteomics) ,如差异 凝胶电泳 ( difference gel electrophoresis ,DIGE) 和同位素代码标记 (isotope coded affinity tags , ICAT) ,对以双向电泳为核心的传统方法进行 了改进 ,它们正在得到进一步的应用和研究 。
[23 ] Noèl2Georis I , et al. [ J ] . J Chromatogr B , 2002 , 771 : 2212236.
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