生物样本前处理技术

【讨论】生物样本前处理技术

样本前处理技术在分析方法中占有极其重要的地位，很多分析问题都可以通过样本前处理解决，本文将对样本前处理过程中遇到的问题和样本前处理方法进行综述，以期形成一个系统。本文将分为

1.样本分类及采集

2.初步处理

3.游离药物分离

4.萃取技术

5.萃取后过程

五个部分进行分别阐述。

其中有不少为个人观点，希望各位战友能不吝指正（纠正错字，纠正观点，进行讨论都欢迎），希望和园内战友共同学习。

-------------------------------------------------------------------------------- 楼主快点介绍吧。

-------------------------------------------------------------------------------- 1.1 生物样本分类

生物样本多种多样，有血浆、血清、全血、淋巴、唾液、各种组织、毛发、尿液、胆汁、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便以及呼出的气体。（以下文字主要摘自《体内药物分析》姚彤伟编著 2001年）生物样品可大致分为

①均匀样品：血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、淋巴液、乳汁和性腺分泌液等体液；

②非均匀样品：心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、生殖器官、脑、体脂、胸腺肾上腺和骨骼肌等11种器官、组织。

Ruth Endacott[1]总结了临床样本采集时需要注意的问题以使采样够用和适用。

[1]:Endacott R, Botti M. Clinical research 3: sample selection. Intensive Crit Care Nurs. 2005 Feb;21(1):51-5.

1.2 生物样品采集

1.2.1 血样

组成

血样包括血浆、血清和全血，其中最常用的是血浆。一般认为，药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度是与药物在作用点的浓度紧密相关的，即血浆中药物浓度可以反映药物在体内(靶器官)的状况，而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。

欲借助血药浓度来了解药物体内的转运规律和用于剂量调整, 应待药物在血液中分布均匀后再取样。直接抽取动脉血或自心脏取血无疑是最理想的方法，因为动脉血中的药物已充分混匀，但此法仅适用于动物实验研究。就采血方式而言，目前使用较多的方法是自静脉采血，并且视采血次数的多少和实验方法需要，一般每次采血1－5ml。做动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一，以免因血流动力学改变而影响研究结果。表1列出常见动物的采血方法。标准的犬类或猫类动物收集血样方法参见Lucas RL 的综述。血样储存及储存条件参见下表2。

血浆及血清

血浆(plasma)的取得是在加肝素、草酸盐、枸橼酸等抗凝剂的全血经离心后分取上层清液，其量约为全血的一半。血清(serum)则是由血液中纤维蛋白原等影响下引起血块凝结而析出，离心后取上层清液而得，血块凝结时，往往易造成药物吸附的损失。通过制备后的血清一般可以得到全血的40%，而血浆会比血清多，大约占全血的50％，个体差异较大。

血清和血浆有以下三点区别：1。血清中没有纤维蛋白原 2。血清中无参与凝血机制的血浆

蛋白 3。血浆无一些凝血过程中血小板释放的物质。

在药代研究中两者各有优缺点：

1。血浆中含有抗凝物质（肝素或EDTA），可能会干扰化合物的检测（结合等），血清则无。2。血浆中蛋白稍多，可能会在SPE中产生诸如堵柱子等情况，干扰样本制备过程（这一点其实差别不明显）。

3。血浆制备快速，直接低温或常温离心后即可分离，血清制备耗时较长。这一点对药代试验影响较大，因为给药后4小时内一般取血点都较为密集。

但血清分离胶的出现可解决这个问题，详见本文

4。血清的凝血过程可能会因为与药物产生吸附作用，从而减少血清的含量，并且有可能造成浓度不平行现象。

血样采取量受到一定限制，尤其是连续取样时，病人感到负担，不易得到配合。血样一般每次取1-5mL，但随着高灵敏度测定方法的建立，取样可少到0.1-0.3mL，可改用手指取血，从而易为受试者接受。

全血

全血(whole blood)也应加入抗凝剂混匀，防止凝血。

对大多数药物来说，血浆浓度与红细胞中浓度成正比，全血不能提供更多数据，全血药物浓度往往不能很好反映药物的药理作用强度，不能作为作用部位药浓的可靠指标。常选用血浆或血清进行体内药物分析，其原因如下：

1. 血细胞中药物暂时仅作为药物“储库”而失去药理作用，不是反映作用部位药浓的改变，因而不能与药效建立相关关系。

2. 血细胞密集现象。有一些药物如米帕林，它主要集中于白细胞内，只要有生理病理因素导致白细胞增加，就会引起全血药物浓度相应升高，其全血药物浓度变化仅反映白细胞数量的改变，而不是反映作用部位药浓的改变。有些药物(如氯噻酮)可与红细胞结合，其动力学行为与在血浆中不同。

3. 全血净化手续较烦、尤其是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。

但有时必须使用全血进行体内药代动力学研究。在如下情况下，需要使用全血进行PK研究：1. 如环孢A广泛分布于血液各成分中，已采集的血液样品内CsA在血浆、单核细胞和红细胞中的分布会随室温发生变化，见表3。

温度升高后CsA自红细胞中释放量增多，血药浓度上升，因此抗凝血离心分离血浆过程中，室温对血浆药浓就有影响，并且难以控制。抗凝血即使在同一室温条件下，不同时间离心的血浆中CsA浓度亦有变化，在0－1hr内药浓逐渐降低，1－3小时才恒定。另外，由于CsA 有效血药浓度较低，并且药物又大量分布于血细胞中，因此血浆/血清测定其浓度时，达不到仪器检测灵敏度要求。鉴于上述原因，在进行CsA PK研究时就常使用全血样品，而不用血浆或血清[2]。

2. 有时作药物筛查时也会使用全血样本。

全血样品是由血浆和血细胞（包括抗凝剂）组成，是非均匀溶液，测定时必须使血细胞破裂（如测定CsA时加入氢氧化钠，超声或冻融）使之成为均匀溶液。

[2]:《生物药物分析（第二版）》曾经泽 1998年 p33

溶血

血浆如果处理不当会造成溶血现象，溶血大致由以下几方面造成：

a 强烈振荡（包括真空管采血时，抽血针内径太细而导致红细胞破裂；血液注入容器中时未取下针头，或用力推出产生大量气泡；抽血速度过快针尖在静脉中探来探去；注射器与针头连接不好）

b 加入渗透压低于0.9％生理盐水的溶液导致红细胞破裂