基因工程 第五章目的基因的获取

T4 DNA连接酶 15º C
载体自连
重组体
目的基因自连
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2.亚磷酸三酯法
原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连 接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去， 所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的， 具体的合成和延伸过程如图。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
③ cDNA第二链合成
a.自身引导合成法：
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’
cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
5’ 3’
去掉发卡结构
用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会 导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 核酸酶S1 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 3’ 5’
第五章 目的基因的获取
目的基因：
准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
需要克隆的DNA片段
编码某种蛋白质
研究某基因与 疾病的关系
研究某基因结构 和功能的关系
目的基因的获取
化学合成法
直接从染色体DNA中分离
聚合酶链式反应
基因组DNA文库;cDNA文 库
第一节
基因组DNA片段化
一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片断。 酶切
3´
3´
3´ A(A)nA
5´
3´ T(T)nT
5´
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
人 工 接 头 及 其 应 用
Eco RⅠ 5´- CCGAATTCG 3´- GGCTTAAGC
Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
4. 基因组文库的大小
一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
重组体
配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
（2）mRNA的分离纯化
① 原理
利用mRNA都含有一段polyA尾巴， 将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA 等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。 ② mRNA的分离纯化 Column（柱） 分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。
（3）cDNA的合成
① cDNA第一链合成
三种常用基因组文库克隆载体的比较
载体种类
装载量
转 染 率
λ噬菌体 9～22kb 105～106转化子／μgDNA 粘性质粒(Cosmid) 30～45kb 104～106转化子／μgDNA 酵母人工染色体(YAC) 100～1000kb ～500转化子／μgDNA
二、 cDNA文库的构建
1.cDNA library 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进 行保存和扩增，称cDNA文库。
（2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
（3）DNA溶液小孔喷射
注射器法可将100kb以上的DNA剪切成10 kb左右 的片段。
第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。 要求：1、已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 。 2、分子量较小的目的基因的制备
oligo(dT)引导的DNA合成法：
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核 苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在 应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模 板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物 一处开始。
② 降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA 杂交分子中的mRNA。 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA 反转录酶 3’ mRNA cDNA第一链 碱 或RNaseH 5’ 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 5’ 3’
若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106 克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若 用λ噬菌体载体可 构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所 需要的重组体克隆数可以减少到9×105, 而要用柯斯质粒将 40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右, 均可满足建库要求。
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 克隆载体
* 从基因组DNA文 库获取目的基因
基因组DNA文库
存在于转化细胞内由克 隆载体所携带的所有基 因组DNA的集合
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
2. 构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构 建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 （1）对载体的要求 载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。 （2）目前常用的载体 载体系列： 容量为 24 kp cosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb
3. 合成探针序列 4. 定点突变合成
合成带有定点突变的基因片断。
5. 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或 衔接物（Linker）序列。
EcoRI
Adaptor
EcoRI
Linker
DNA合成仪
第三节 PCR扩增获得目的基因
以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在 累述。
* 化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。 ② 带保护的单核苷酸连接 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一 个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 ③ 用酸或碱的脱保护
3. 基因文库构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。 ① 物理切割法： 超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。 ① 粘性末端直接连接 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点连接 ② 平端连接 ③同聚物加尾连接 ④人工接头法（adapter）
二、 化学合成DNA片断的组装 化学合成的DNA片断一般在200bp以内。
1. 互补连接法
（1）互补配对 预先设计合成的片断之间都有互补区 域，不同片断之间的互补区域能形成有断 点的完整双链。 （2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带 上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) PCR 基因放大连琐反应
染色体
PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大
第四节 从基因文库、cDNA文库获取目的基因
一、基因文库的构建 1. 基因文库（gene library） 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片断，并将所有这些片断都与 适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保 存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有 了该生物体的全部基因，因此，称之为基因 组文库（genomic library）或基因文库（gene library）。
2.cDNA (complementary DNA，互补DNA)
是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞 内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。
3. cDNA文库的特点 （1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。 4. 构建cDNA文库的一般步骤 （1）总RNA（total RNA）提取 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
b.置换合成法：
获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失
原 理： 以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为
切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上
造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆
菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链。
（3）连接酶连成完整双链
T4多核苷酸激酶
使5’-OH磷酸化
T4 DNA连接酶
完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法
5’
预先设计的片断之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片断延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。 3’
Klenow片段
引物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3’
5’
T4DNA连接酶
5’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右）
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
目的基因 自连
目的基因
5´ 3´ 5´ 限制酶或机械剪切 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dATP A(A)nA 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´
载体DNA
限制酶 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dTTP T(T)nT 3´ 5´ 3´
ln (1-p) N= ln (1-f)
p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数 N：所需的重组载体数（克隆数）
例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb 目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？ ln（1－0.99） N = ——————————————— = 9.2×106 ln （1－1.5×103／3×109）