动物绿脓杆菌病研究进展_牛钟相

动物医学进展,2003,24(1):16-18

Progr ess in Veterinary M edicine

动物绿脓杆菌病研究进展

牛钟相,李雅林

(山东农业大学动科院,山东泰安271018)

中图分类号:S852.3 文献标识码:A文章编号:1007-5038(2003)01-0016-03

摘　要:随着养殖业规模化的不断扩大,由绿脓杆菌引起的动物疫病有上升趋势。近年来,有关绿脓杆菌导致的疫病主要有:规模化养狐场母狐的流产、羊群的化脓性肺炎、雏鸡的败血症等,其他动物绿脓杆菌病的报道也日渐增多。该菌给规模化养殖场造成了很大威胁。为了探讨有效控制本病的方法,特对动物绿脓杆菌病的流行病学、病原学、临床症状、病理变化及发病机理、诊断、防制等方面的研究情况进行综述。关键词:绿脓杆菌;致病性;外毒素A

绿脓杆菌(B acillus p y ocy aners),也称铜绿假单胞杆菌(P seudomonas aeruginosa),1882年首先由Gersard氏从伤口脓液中分离到。该菌在自然界中分布广泛,可引起多种动物的脏器脓肿,如奶牛的子宫炎和乳房炎等。近年来,随着集约化的不断扩大,该菌导致的疾病表现为群体的急性暴发,死亡率增高。动物绿脓杆菌病调查结果表明,绿脓杆菌是鹌鹑化脓性肝炎、水貂出血性肺炎、獐子麝囊化脓、长臂猿化脓性角膜炎等病的原发性或并发性病原。绿脓杆菌对牛、羊、兔、大熊猫、鸭等动物的感染也都有了大量的报道[1-2]。近年来,山东农业大学兽医微生物室也对绿脓杆菌病做了大量研究工作,取得了许多可喜成果。

1　发病情况和流行病学

绿脓杆菌广泛存在于水、土壤、空气、动物的肠道和皮肤,为一种条件性致病菌。该菌是一些疾病如脑膜炎、奶牛乳房炎、子宫炎、鸡霉形体病、粘膜型鸡痘的继发菌,同时也常与其它菌混合感染,如与葡萄球菌和大肠杆菌的混合感染等病例都有报道。近年来,随着集约化的不断扩大,绿脓杆菌原发病的发病率显著上升,往往会造成幼小畜禽的大群暴发。注射污染、环境恶劣、营养不良、疲劳运输等应激因素是造成该病暴发的原因所在,应激因素使机体对本菌的入侵缺乏足够的抵抗力,从而导致发病。如雏鸡往往因接种马立克氏疫苗造成感染,引起绿脓杆菌病暴发。何虎成等报道[3],由于注射马立克氏疫苗引起雏鸡死亡率达40%。金美玲等报道[4], 1日龄雏鸡因感染绿脓杆菌发生脐带炎,死亡率达7. 2%。张明智报道[5],河北某兔场发生绿脓杆菌病,全部顺产仔兔相继于产后4～6d内死亡,分析死亡原因为:病兔的粪、尿等分泌物以及被污染的饲料、饮水及笼具等成为本病的传染源,从而引起该病暴发。

收稿日期:2002-06-11

作者简介:牛钟相(1951-),男,山东安丘人,山东农业大学动物科技学院教授,博士生导师,主要从事兽医微生物学与免疫学等方面的教学与研究工作。 山东农业大学对鸡、狐狸、羊的绿脓杆菌病也进行了详细的研究。研究发现狐狸多在3～4月份配种季节,由于狐场内不清洁等原因造成母狐绿脓杆菌感染,从而导致母狐子宫化脓、流产。尹燕博报道[6],山东某狐狸养殖场每年春季约有一半以上的母狐狸发生空怀、死胎和流产,是母狐感染绿脓杆菌所致,与山东农业大学研究结果相一致。对羊绿脓杆菌病研究结果发现,该菌可引起羊的一种慢性化脓性肺炎,该病多发生在冬末春初、阴冷潮湿的季节,饲养密度过大、通风不良易导致本病发生,易感年龄为2～2.5岁,发病率30%～60%,死亡率20%～40%。用研制的羊绿脓杆菌诊断原对山东省部分地区羊场(246头羊)进行的血清学抽样调查结果表明,阳性率高达94.7%。彭大新等[7]报道,某羊场发生的羊绿脓杆菌病发病率80%以上,死亡率23%,与山东农业大学研究结果相似。

目前,从上述报道的几十种动物的绿脓杆菌病统计发现,鸡的发病率最高[8-11]。值得注意的是,该菌对同一种动物致病后引起的症状也有很大差别。

2　病原学

2.1　形态观察

绿脓杆菌为假单胞菌属(P seudomonas),革兰氏染色阴性,是两端钝圆的短小杆菌,无荚膜、无芽胞[11]。所有菌株都能运动,电镜下观察,菌体为一端单鞭毛并有很多菌毛,菌体大小为1.5～3.0L m×0.5～0.8L m,单个存在或成双排列,偶见短链。

2.2　培养特性

本菌在普通培养基上生长良好,为圆形、光滑、湿润、扁平的菌落。该菌能分泌两种色素,一种为绿脓素(Py ocy anin),另一种为荧光素。绿脓素可溶于水或氯仿中,而荧光素仅溶于水,不溶于氯仿。绿脓素是一种蛋白质,分子量4.5万,该色素可使肝细胞肿胀,变性和坏死,可引起腹泻,并有抑菌作用。山东农业大学研究发现,绿脓杆菌产色素能力因传代而很容易丧失,但可通过在培养基中加1%血清、接种雏鸡等方法恢复其产色素能力。绿脓杆菌的某些菌株不产生色素,或只在特定的培养基上才产生色素,在血琼脂培养基上能产生明显的B-溶血,该菌能在NAC鉴别培养基上产生绿色荧光。绿脓杆菌最高生长温度为42℃,能在含50g/L Na-Cl的培养基中生长。

2.3　生化特性

绿脓杆菌发酵糖的能力不强。分解葡萄糖产酸不产气,属氧化型糖代谢,分解缓慢。对其他糖类一般不分解。不产生靛基质,能形成硫化氢,能还原硝酸盐为亚硫

酸盐,能液化明胶。

2.4　毒素及其致病性

绿脓杆菌可分泌内毒素和外毒素。内毒素是构成细胞壁的一种酯醣体,毒力较弱,2～3mg才能致死20g 体重的小白鼠;外毒素有两种,一种为毒力很强的外毒素A,是一种致死性外毒素,国内外目前研究结果证明,外毒素A是绿脓杆菌最主要致病因子。用5～10LD50腹腔注射小白鼠可引起白细胞和血小板迅速减少,凝血时间延长。外毒素A可用福尔马林脱毒成为类毒素,使其毒力减弱,但保持其抗原性,有防制绿脓杆菌感染的作用。山东农业大学研究发现,菌株PA-SD-1(分离自羊)产生的外毒素A毒性较弱,但具有很强的免疫原性,注射家兔后抗体滴度高达10log2;通过对外毒素AIII区基因进行克隆并与标准株PA103的碱基比较发现,PA-SD-1发生了8个碱基的点突变,由此所致4个氨基酸发生变异,而这4个氨基酸中有两个发生了酸碱性的变化,这很可能影响外毒素A的结构,从而影响其毒性。另一种外毒素为磷酯酶(Phosphipase)C,是一种溶血毒素,它给入侵的细菌提供营养,增强绿脓杆菌的毒力,它还能破坏肺组织表面成分,造成出血、萎缩和坏死,也常引起脓胸。绿脓杆菌分泌的色素也是毒素之一,可抑制机体吞噬细胞的吞噬作用,也有抑菌的能力,是一种抗菌素样物质。目前,国内外对外毒素A、磷脂酶C、绿脓色素等致病因子的报道较多,已成功[12-14],对外毒素A进行了提取、克隆、表达。

2.5　血清学分型

本菌型别十分复杂,分型系统混乱,目前,还没有统一的分型标准。但各国多采用血清学分型方法,通过抗原与抗体的直接凝集即可达到分型目的。此法具有很大实用价值,且操作简便、敏感度较高。血清学分型最初由Hards氏(1975)提出,直至1983年Liu P V氏提出国际抗原分型表(IA TS),中国暂行的方案则以袁昕氏(1963)和Verder氏(1961)的分型为基础,选出我国从人体分离的12个菌株为代表即I-XⅡ型。目前,多用卫生部成都生物制品研究所研制的IAT S-20型分型血清进行分型。国内外许多学者[15]研究了血清型与耐药性的关系及血清型与感染类型的关系,发现有一定相关性,这为诊断和防制本病提供了依据。绿脓杆菌除了血清学分型外,尚有噬菌体分型和绿脓菌素分型等方法。前者影响因素较多,后者有一定的应用价值,其缺点是对某些绿脓菌素分泌能力低甚至不产色素的菌株就失去分型价值。

2.6　变异性

绿脓杆菌的无色素变种日益增多,菌落形态上可变异为粗糙型(R)和粘液型(M)菌落。

2.7　抵抗力

绿脓杆菌对外界环境的抵抗力较其它细菌要强,对干燥、紫外线的抵抗力也较强,在潮湿处能长期生存,55℃加热1h才能将其杀死。本菌对多种抗生素不敏感,但对庆大霉素、多粘菌素和羧苄青霉素敏感。但是,各菌株的药物敏感性也不完全相同。

2.8　粘附因子

绿脓杆菌对上皮细胞的粘附是引起感染的第一步。因此,对其粘附因子的研究近来很受重视,W oods用口腔颊上皮细胞研究了由呼吸道感染病人分泌物中分离的PA菌株的粘附情况,证明菌毛是其粘附素。Ram-phal和Pier用损伤的小鼠支气管上皮细胞研究从肺囊性纤维变病人中分离的粘液型(M coid)菌株的粘附作用,指出PA的粘液型外分泌多糖(Muco id ex opolysac-charide,M EP)是其粘附素。

3　临床症状

该菌主要引起各种动物的化脓性炎症及败血症。该菌感染鸡后,可引起肺炎、肝周炎、心包及心肌炎、败血症、关节炎、眼炎,但每次暴发所引起的症状并不一致;鸭有引起眼炎的报道;奶牛感染后可引起拉稀;水貂感染可引起出血性化脓性肺炎;此外还有引起狐狸流产和兔肺炎的报道。山东农大研究发现,羊感染后,可发生慢性化脓性肺炎,主要表现羊咳嗽、气喘、消瘦,病程长短不一,多持续2～3个月,剖检病死羊发现多数肺脏呈大叶性肺炎,整个胸腔积满浓液,有的病例肺部水肿,肺尖肉变。

4　发病机理和病理变化

绿脓杆菌长期存在于动物和人的皮肤、消化道、呼吸道和尿道中,成为健康带菌者。若体内外有创伤,首先在入侵之处定居下来,并迅速分裂繁殖,在多数情况下形成局灶性脓肿。幼年动物因免疫系统尚不健全,病原菌即可沿着淋巴系统进入体内,并在组织中扩散蔓延,最后进入血液中引起菌血症,或在各脏器中形成多发性脓肿。本菌在代谢过程中产生溶血素使大量红细胞溶解,血液成分改变、血管壁受损和循环系统障碍,最终导致实质器官充血或出血。本菌代谢过程中产生的外毒素A和磷酯酶C,在体内有抑制或杀死吞噬细胞的能力,使宿主抵抗力下降。尤其外毒素A被认为是一种致死毒素。将这种毒素注射于家兔皮肤,18h后可引起局部脓肿,在脓肿周围形成红色硬结或水肿,48h后出现坏死。研究发现,外毒素A通过受体结合亚单位和跨膜亚单位将具有ADP-核糖基化活性的毒性单位导入细胞,催化细胞内的延伸因子(EF-2)发生ADP-核糖基化反应,使EF-2灭活,抑制蛋白合成而杀死细胞。对于绿脓杆菌的各种致病因子的致病作用及致病机理仍是目前绿脓杆菌研究的热点。

5　诊断

根据本病的流行病学特点、临床症状表现及其病理变化,再进行细菌学检验、血清学定型等才能作出完整的诊断报告。细菌学检验是诊断绿脓杆菌病最可靠的方法。挑取单个可疑菌落接种于NAC鉴别培养基上培养18h,置室温下逐渐产生明显的色素,此种色素渗透入培养基中。涂片镜检为革兰氏阴性杆菌,即可判定为绿脓杆菌。少数菌株在NAC培养基上不产生色素,但如果在42℃和50g/L NaCl溶液中能够生长,氧化酶、乙

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牛钟相等:动物绿脓杆菌病研究进展