细胞悬浮培养

5.4 细胞增殖的测定
1. 细胞鲜重 将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的 湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去 湿尼龙丝网上，用水洗去培养基， 细胞上沾着的多余水分，称重， 细胞上沾着的多余水分，称重，即求得细胞鲜重 （fresh weight）。 weight）。
2.细胞干重 2.细胞干重 用已知重量的干尼龙丝网依1的方法收集细胞， 用已知重量的干尼龙丝网依1的方法收集细胞， 在60℃下干燥48 h或80℃下干燥36 h，细胞干重恒 60℃下干燥48 h或80℃下干燥36 h， 定后，再称重。细胞干重（ weight） 定后，再称重。细胞干重（dry weight）以每毫升 培养物或每10 个细胞的重量表示。 培养物或每106个细胞的重量表示。
化学方法的原理是使细胞遭受某种营养饥饿， 化学方法 的原理是使细胞遭受某种 营养饥饿 ， 或 的原理是使细胞遭受某种营养饥饿 生化抑制剂阻止细胞完成其分裂 是通过加人某种生化抑制剂 是通过加人某种 生化抑制剂 阻止细胞完成其分裂 周期。化学方法中常用的有饥饿法 抑制法两种 周期。 化学方法中常用的有 饥饿法 和 抑制法 两种。 饥饿法和 两种。
加入培养基
排出培养基及其培养物
连续培养的类型 封闭型 开放型
封闭型连续培养的特点
排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充， 排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充， 进出数量保持平衡。 进出数量保持平衡。 悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来 悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来 之后，又被放回到培养系统中。 之后，又被放回到培养系统中。 随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。 随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。
1. 尽可能使用易散碎的愈伤组织 愈伤组织的结构是受遗传因子控制的， 愈伤组织的结构是受遗传因子控制的，因而 有时无论采用什么办法也难于使细胞充分分散。 有时无论采用什么办法也难于使细胞充分分散。 不过，一般来说， 不过，一般来说，如果培养基的成分和继代方法 选用得当，总有可能提高细胞的分散程度。 选用得当，总有可能提高细胞的分散程度。
（一）饥饿法 在这种方法中， 在这种方法中 ， 先对细胞断绝供应一种进行 细胞分裂所必需的营养成分或激素， 细胞分裂所必需的营养成分或激素 ， 使细胞停滞 在 G1 期或 G2 期 ， 经过一段时间的饥饿之后 ， 当重 期或G 经过一段时间的饥饿之后， 新在培养基中加入这种限制因子时， 新在培养基中加入这种限制因子时 ， 静止细胞就 会同步进入分裂。 会同步进入分裂。
5.1悬浮培养的方法
分批培养
连续培养
（一）分批培养(batch culture)
是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定容 积的培养基中进行培养， 积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培 养物。 养物。
分批培养的特点
在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可 以同外界空气交换外，一切都是密闭的， 以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养 基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长 基中的主要营养物质耗尽时， 即行停止。 即行停止。
培养基的振荡
首先， 首先 ， 它可对细胞团施加一种缓和的压力使它 破碎成小细胞团和单细胞； 们破碎成小细胞团和单细胞； 其次， 其次，振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保 持均匀的分布。 均匀的分布。 此外， 此外，培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之 间的气体交换。 间的气体交换。 气体交换
开放型连续培养的特点
注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液 及其中细胞的容积相等。 及其中细胞的容积相等。 培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的 恒定水平上（通过调节流入和流出的速度） 恒定水平上（通过调节流入和流出的速度） 。
开放型培养又可分为两种主要方式： 开放型培养又可分为两种主要方式： （控制生长速度的方法） 控制生长速度的方法） 一是化学恒定式； 一是化学恒定式；
3.细胞密实体积 3.细胞密实体积 为了测定细胞密实体积（ 为了测定细胞密实体积（packed cell volume, PCV )，将一已知体积的均匀分散的悬浮液 ， （10~20 mL）放入一个刻度离心管（15~50 mL） ）放入一个刻度离心管（ ） 下离心5 中，在2 000~4 000 r/min下离心 min。细胞密实 下离心 。 体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。 体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。
悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 物理方法和化学方法。 物理方法和化学方法。 物理方法主要是通过对细胞物理特性 物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细 主要是通过对细胞物理特性（ 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等） 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 进行选择的方法和低温休克法等。 进行选择的方法和低温休克法等。
5 细胞悬浮培养
细胞悬浮培养（ 细胞悬浮培养（cell suspension culture） ）
是指将游离的单细胞或细胞团按照一定的细 胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。 胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。
这种培养方法能提供同步分裂的、 这种培养方法能提供同步分裂的、增殖迅速的大 量细胞，可用于大规模的工业化生产。 量细胞，可用于大规模的工业化生产。
在悬浮培养中，为了使培养基能不停地运动， 在悬浮培养中，为了使培养基能不停地运动，可以 使用各种类型的设计。 使用各种类型的设计。
(1)旋转培养 旋转培养 (2)往返震荡培养 往返震荡培养 (3)旋转震荡培养 旋转震荡培养 (4)搅动培养 搅动培养
旋转培养器
Leabharlann Baidu
液晶屏双层震荡培养器
磁力搅拌培养器
4.选择单细胞和小细胞团进行继代 选择单细胞和小细胞团进行继代
在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注 射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 射器 ， 但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 胞和小细胞团（ 胞和小细胞团 （ (2-4 个细胞 ） ， 而不能通过大的 个细胞） 细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒， 细胞聚集体。 继代前应先使三角瓶静置数秒 ， 以 便让大的细胞团沉降下去， 便让大的细胞团沉降下去 ， 然后再由上层吸取悬 浮液。 浮液。
3.加新鲜培养基 3.加新鲜培养基
如果每隔1d加一次新鲜培养基， 如果每隔 加一次新鲜培养基，使生物量 加一次新鲜培养基 与培养基容积之比保持为2，这样， 与培养基容积之比保持为 ，这样，悬浮培养 细胞即可长期保持在对数生长晚期， 细胞即可长期保持在对数生长晚期，于是就有 可能使细胞最大程度分散。 可能使细胞最大程度分散。
滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长， 当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长， 而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。 而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。 如果转入的细胞密度很低， 如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞 或小群体细胞所必需的营养物质之前， 或小群体细胞所必需的营养物质之前 ， 细胞将不能 生长。 生长。
5.3 悬浮培养细胞的同步化
同步培养是指在培养中大多数细胞都能同时通过 细胞周期的各个阶段(G1，S，G2和M)。同步性程度 ， ， 和 。 细胞周期的各个阶段 以同步百分数表示。 以同步百分数表示。
确定同步性的参数 ①在某一时刻处于细胞周期某一点上的细胞的百 在某一时刻处于细胞周期某一点上的细胞的百 细胞周期某一点 分数； 分数； ②在一个短暂的具体时间内通过细胞周期中某一 在一个短暂的具体时间内通过细胞周期中某一 点的细胞的百分数； 的细胞的百分数； ③全部细胞通过细胞周期中某一点所需的总时间占 全部细胞通过细胞周期中某一点所需的总时间占 细胞周期中某一点 细胞周期时间长度的百分数。 细胞周期时间长度的百分数。
如果把愈伤组织在半固体培养基上保存2-3个继代周期， 如果把愈伤组织在半固体培养基上保存 个继代周期， 个继代周期 其松散性常会增加。 其松散性常会增加。
2. 加入特殊物质（较少细胞之间的联系、减慢细胞分裂 较少细胞之间的联系、
的速度） 的速度）
已知加入2, 4少量水解酶（ 已知加入2, 4-D，少量水解酶（如纤维 素酶和果胶酶），或加入酵母浸出液一类的 素酶和果胶酶），或加入酵母浸出液一类的 ）， 物质，都能促进细胞的分散。 物质，都能促进细胞的分散。
分批培养所用的容器
一般是100～ ml三角瓶 三角瓶， 一般是100～250 ml三角瓶， 100 每瓶中装有20～ ml培养 每瓶中装有20～75 ml培养 20 基。
为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代， 为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方 法是取出培养瓶中一小部分悬浮液， 法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜 培养基中（大约稀释5 培养基中（大约稀释5倍）。
二是浊度恒定式。 二是浊度恒定式。
5.2 细胞悬浮培养的培养基
能用来建立生长快、 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培 养基， 养基，一般来说也同样适用于建立该物种的悬浮 培养，只是琼脂当然要从中去掉。 培养，只是琼脂当然要从中去掉。
条件培养基的使用方法
条件培养基是在其中曾培养过一段时间植物组 条件培养基是在其中曾培养过一段时间植物组 织的培养基。 织的培养基。 简便方法是把在液体培养基中培养了4～ 周的 简便方法是把在液体培养基中培养了 ～6周的 高密度细胞滤掉， 高密度细胞滤掉，而用它的培养基制成悬滴或薄层 来培养单细胞或低密度细胞群体。 来培养单细胞或低密度细胞群体。
另外， 如果缩短两次继代的时间间隔， 例如， 另外 ， 如果缩短两次继代的时间间隔 ， 例如 ， 每 2 ～ 3d 即继代一次 ， 则可使悬浮培养的细胞一 即继代一次， 直保持对数生长。 直保持对数生长。
据报道，加入条件培养基（ 据报道 ， 加入条件培养基 （ 即在其中曾培养过一 段时间植物组织的培养基） 段时间植物组织的培养基 ） 可以显著缩短滞后期 的长度。 的长度。
（二）连续培养（continuous culture）
指在培养过程中，不断注入新鲜培养基， 指在培养过程中，不断注入新鲜培养基，排
掉用过的培养基，保持培养物的容积恒定， 掉用过的培养基，保持培养物的容积恒定，使培养 液中的营养物质得到不断补充。 液中的营养物质得到不断补充。
连续培养图示： 连续培养图示：
如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太 则会引起细胞的大量死亡和解体。 因此， 长 ， 则会引起细胞的大量死亡和解体 。 因此 ， 当 细胞悬浮液达到最大干重产量之后， 即在刚进入 细胞悬浮液达到最大干重产量之后 ， 静止期的时候，须尽快进行继代。 静止期的时候，须尽快进行继代。
提高细胞分散程度的方法
但是必须记住， 但是必须记住 ， 即使在分散程度最好的悬浮液 中也存在着细胞团， 中也存在着细胞团 ， 每个细胞团由几个或几十 个细胞组成， 个细胞组成 ， 只含有游离细胞的悬浮液是没有 这是因为植物细胞具有集聚在一起的特性 集聚在一起的特性， 的 。 这是因为植物细胞具有 集聚在一起的特性 ， 由一个初始细胞经过分裂产生的若干个子细胞， 由一个初始细胞经过分裂产生的若干个子细胞 ， 不能像子代细菌那样各自分散在培养液中。 不能像子代细菌那样各自分散在培养液中。
（二）抑制法 使用DNA 合成抑制剂如 氨基尿嘧啶、 使用 DNA合成抑制剂如 5- 氨基尿嘧啶 、 羟基脲和 合成抑制剂如5 胸腺嘧啶脱氧核苷等， 也可使培养细胞同步化。 胸腺嘧啶脱氧核苷等 ， 也可使培养细胞同步化 。 当 细胞受到这些化学药物的处理之后， 细胞受到这些化学药物的处理之后 ， 细胞周期只能 进行到G 期为止， 细胞都滞留在G 期和S 进行到 G1 期为止 ， 细胞都滞留在 G1 期和 S 期的边界 上 。 当把这些抑制剂去掉之后 ， 细胞即进 入 同步分 当把这些抑制剂去掉之后， 细胞即进入 裂 。 应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细 胞周期。 胞周期。