花粉生活力测定

（三）TTC法：（染色法） TTC即2、3、5-三苯基四唑氯化物。主要原理在于检验花 粉呼吸过程中脱氢酶的活性。2、3、5-氯化三苯基四氮唑 (TTC)的氧化状是无色的，被氢还原时成红色的TTF。 具有活力的花粉呼吸作用较强，由于呼吸作用产生的氢能 使TTC还原成TTF，因此花粉便染成红色；而无生命的花 粉没有呼吸代谢活力，TTC不被还原，因而不着色。所以， 可根据花粉染不染成红色来判断有无生命力，从而测定花 粉生活力。
（二）联苯胺法：（染色法）
具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利 用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色， 依据颜色可知花粉有无活性。实验中甲液成分为联苯胺， α-萘酚、碳酸钠，乙液成分为过氧化氢。
H2O2 + 酚
（无色）
过氧化氢酶
醌 + H2O
（红色、玫瑰红色）
1、配制药液 a．0.2克联苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液； b．0.15克a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液； c．0.25克的碳酸钠溶解在100毫升的蒸馏水中。 以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用 d.使用时将这三种溶液等量配成“甲液”，放入棕色滴瓶中 备用， e.将过氧化氢用蒸馏水稀释成0.3%的溶液作为“甲液”，随 配随用。 2、观察 取花粉少许撒入凹型载玻片，然后在花粉上滴“甲液”一滴， 片刻后，再滴入“乙液” 一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片。 经3～5分钟后，再放在显微镜下检查。 有生活力的花粉呈红色或玫瑰红色，不着色者为无生活力的 花粉。为了确定具有生活力的花粉百分率，要连续观察3～5 个视野，求其平均值，将观察结果填入表内。
配置培养基（ 100ml水+1g+琼脂+0.01g硼酸+ 5-20g糖 ） 煮沸溶化 用玻棒分装与凹玻片中 播撒花粉 置于培养皿中20-25℃恒温培养数小时 保持湿度 在显微镜下镜检计数
【注意事项】 1.不同种类植物的花粉萌发所需温度、蔗糖和硼酸浓度不同，应依植物种类而改变 培养条件。 2.此法也可用于观察花粉管在培养基上的生长速度以及不同蔗糖浓度，离体时间， 环境条件等因素对花粉活力的影响。 3.不是所有植物的花粉都能在此培养基上萌发，本法适用于易于萌发的(葫芦科等)植 物花粉活力的测定。
三、实验用品
1、材料 正在开花的植株花粉（百合） 2、器具 盖、载玻片 凹式载玻片 培养皿 滴管 镊子 解剖 针 吸水纸 水浴锅 恒温箱 天平 烧杯 玻棒 电炉 荧光显微镜 普通显微镜
3、药品 蒸馏水 硼酸 蔗糖 琼脂 联苯胺 α-奈酚 碳酸钠 过氧化氢 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 氯化三苯基四 氮 丙酮 二丙酸酯荧光素
四、内容与方法
（一）培养法： 1、配置培养基 取100ml蒸馏水中，加1~2g（即1%~2%）琼脂煮开， 使之溶解，然后再加入一定量的蔗糖或葡萄糖和0.01g 硼酸，制成不同浓度（5%、10%、15%、20%）的蔗 糖琼脂培养基。 2、制片 用玻棒蘸少许培养基，趁热滴入凹形载玻片，放置片 刻，待凝固后，撒上少许花粉粒。注意要均匀，不可 过多，否则，在显微镜下，不易分清数目。 3、培养 将制好的玻片放于培养皿，下面垫有脱脂棉，加入少 量水，以保持湿度。将培养皿盖好，置于20~25℃恒 温箱中。
实验五
花粉生活力的测定
一、实验目的 学习和掌握花粉 生活力测定的方 法
花ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ粉
二、实验原理
作物杂交工作中，往往会遇到父母本花期不遇，必须采集 花粉短暂贮藏，经贮藏的花粉及其生活力如何，必须经过 测定，以保证杂交效果。此外，花粉的生理研究，作物雄 性不育和远缘杂交都要鉴定花粉育性和生活力。
正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。 花粉生活力的高低直接影响植物授粉、受精乃至坐果。
（2）与形态观察相同，但在有花粉的载玻片上滴1滴1%I—IK，再观察花粉 是否染色和染色深浅情况，以判断花粉内含物的充实度。正常花粉应有较 多的淀粉粒，遇I—IK呈紫黑色，不正常的染色浅或不染色。
对于新采集的花粉来说，还有一个更为简便的鉴定方 法——形态鉴定法。将花粉用解剖针播于一般载玻片 上，然后直接放到显微镜下观察，根据形态特征，判 断花粉的生活力状况，一般来说，畸形、皱缩、小形 化等均为无生活力花粉，而有光泽、饱满、具有本品 种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。
1、配制溶液 （1）磷酸缓冲液：在100ml的蒸馏水中，溶解0.832克的 磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾,调整pH值为7.17。 （2）TTC溶液：称取0.02~0.05克(不同植物所用的量是 不同的)的TTC溶解在10ml的磷酸缓冲液中,溶液配好后装 入棕色瓶内，置入暗处。 【注意事项】因氯化三苯基四唑有毒，操作时要注意安全。 2、操作步骤 （1）取少量花粉放在载玻片上，并在花粉上滴上1~2滴配 制液，用玻璃棒混合盖上盖玻片。 （2）将载玻片置于恒温箱中（35~40℃）约15~20分钟。 （3）在显微镜（10X10）下观察：凡具有生活力的花粉呈 红色，部分丧失生活力的呈淡红色，无色的是死的和不育 的花粉粒。
要根据各种植物花粉的特点，采取适当的保存方法。花粉生活力的测定方法很 多，其中发芽试验手续较复杂，设备要求较高，需时也较长。为了简易而迅速 的测定花粉生活力，也常采用化学染色的方法，但是此法也有缺点，就是染上 色的花粉不一定都具有生活力，因为染上色的花粉中也包括了那些生活力弱不 能正常发芽的花粉，所以一般常用而且较为可靠的方法仍然是采用花粉发芽实 验。要是要求不严格对新采集的花粉还有一个较简便的鉴定方法——形态鉴定 法。 本实验目的是学习花粉生活力测定的方法，进而研究花粉寿命长短与环境条件 的关系，以探求保存花粉的合适方法。
将适量花粉置于载玻片上
先滴1滴甲液，再滴1滴乙液 充分反应 显微镜下镜检计数，红色的为有活力的花粉
【注意事项】 滴加甲液和乙液后，会产生大量的气泡，为了不影响观察，应 待反应充分完毕后在加盖玻片观察，可以用镊子轻轻搅动，加速 反应，待气泡基本消失后方可观察。统计生活力的方法同前。
★染色法用时短，见效快，但颜色判断易受个人因素影 响，导致结果有较大差别。
花粉发芽法 人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况 来鉴定花粉生活力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实 际不完全相符，所得的结果与实际有一定的差异，但操作方 便，能测定出相对发芽率来。
★简便，但是一般用于要求不严格新采集的花粉
花粉发芽鉴定：配制一定浓度的蔗糖溶液
等作培养基，在人工控制条件下进行花粉发 芽试验，根据花粉发芽率的高低衡量花粉生 活力。也可以在授粉数小时后直接观察柱头 花粉萌发伸长情况。
染色鉴定：用不同的化学试剂如氯化三苯
基四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride、C12H15N4Cl，简称TTC或四唑）、 联苯胺茶酚等快速鉴定花粉生活力。
五、结果与分析 1、将培养基法和染色法两种方法测得的结果 列表记录，并计算花粉的生活力。 2、比较测定花粉生活力三种方法的优缺点。 3、绘制一花粉粒发芽形态图。
形态鉴定
（1）在载玻片上置少量正常的稻、麦或棉的新鲜花粉，于低倍显微镜下观 察花粉形态。不同育性和生活力的花粉在形态上有明显差异。水稻和小麦 不育花粉空秕畸形，可育花粉饱满球形；棉花不育花粉呈半圆形和棒状， 大小也参差不齐，可育花粉均为圆形，大小整齐一致。
4、镜检 在显微镜下隔一定时间检查一次（花粉发芽快的经过 几个小时即可观察到已经发芽，慢的需24小时以上）， 若发现花粉已发芽时，就随机地在显微镜下取5个视野， 记录花粉粒总数和发芽数，算出平均值，将观察结果填入 表内。 花粉发芽的标准，以花粉管伸长超出花粉直径为准。 若花粉发芽率在5%以下，为极弱，不能采用。 （花粉发 芽率=发芽花粉总数\花粉总数*100）培养过程要密切观察， 不可使花粉管萌发的太长，否则难以计数。 ★ 培养基法能够统计出百分率，准确 度高，但是操作相对复杂，而且花粉 发芽条件与实际不完全相符易受培养 基配方的影响导致结果的偏差。
3、观察和测定结果：每片观察3个视野，并统计具有生 活力的花粉的百分率。
（四）荧光法： 1、溶液配制 （1）50mg二丙酸酯荧光素溶于10ml丙酮中。 （2）0.5M蔗糖溶液100ml. （3）取10ml 0.5M蔗糖溶液，将5mg/ml二丙酸酯荧光素 溶液逐滴加入蔗糖液中至饱和，为染液。 2、操作步骤 （1）滴1滴染液于载玻片上。 （2）将供试花粉撒在染液中。 （3）静置5分钟。 （4）加盖片后于荧光显微镜下观察。（激发BG12）
花粉生活力测定的方法较多，常用的有：形态鉴定、花粉 发芽鉴定、染色鉴定 。
形态鉴定： 花粉有无生活力在形态上有明显差异，即形 态是否发育正常，其内部淀粉等内含物是 否充实。发育不正常的花粉，内含物不充 实而空秕，形状也不规则，大小参差不齐。 而正常花粉内含物充实饱满，形状规则， 大小整齐。因内部含有较多淀粉粒而遇 1%I-IK溶液呈深紫色反应，遇水易吸涨而破 裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代花 粉形态和育性的鉴定。