4.人工染色体载体

当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
DNA连接酶
具有两个cos位点的二联体线形DNA分子
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将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、
分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染
色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染
色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像
天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗
传。
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利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片
段复制的载体称为人工染色体载体。其装载
λDNA片段除了cos位点 之外，在其两侧还具有 与噬菌体包装有关的 DNA短序列； 质粒DNA部分则是 一个完整的复制子。
克隆能力为31～45kb， 而且能够被包装成为 具有感染性能的噬菌 体颗粒。
三、 cosmid克隆载体的特征
包括以下4个方面 ①构建的cosmid克隆载体是一种环形双链
DNA分子，—般在5--7kb。
有感染力的颗粒。

由于cos质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组 DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。
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第一节

黏粒（cosmid）载体
PstI BamHI Tcr SalI
一类人工构建的含有λ-
DNA cos序列和质粒复制
子的特殊类型的载体。

Apr
1978年Collins和Hohn发 明构建 1.8 kb的λ-DNA片段 + pBR322片段
个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～
45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能 插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装 成噬菌体颗粒的限度；
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③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯
斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一
DNA片段的菌落很费时间。
ori
pHC79 6400 bp
l fragment
9

cos
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第一节
黏粒（cosmid）载体
Apr
黏粒克隆载体（柯
PstI
BamHI
斯质粒载体）实际上
是质粒的衍生物，是
Tcr SalI
pHC79 6400 bp ori cos
由英文“ cos sitecarrying plasmid”缩
l fragment
cos
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一、黏粒的结构特征和用途
黏粒它的大小一般 5-7kb 左
右，用来克隆大片段 DNA，
装载范围为31 – 45，克隆的 最大 DNA 片段可达45kb。
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
①质粒复制起点（colE1） 象
质粒一样转化和增殖。
pHC79 6400 bp ori cos
五、 cosmid克隆载体（自学P72）

Fra Baidu bibliotek
常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和 KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性
内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量
载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重
组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的
阳性检出率，而且极其适合高等真核基因
的克隆工作。
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pBR322质粒(p43)
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用λ噬菌体基因组的cro—rⅡ的BglⅡ限制
片段，取代pBR322质粒DNA的位于1 459～1
666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ单
切割位点的重组体分子。 然后通过这个位点，将带有cos序列、长度 为1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入进去，于是 得到了pHC79柯斯质粒.
③具有λ噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一
个cos位点。
cosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源 DNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以 高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
进入寄主细胞之后的cosmid克隆载体DNA
分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起
来。 但由于cosmid克隆载体并不含有λ噬菌体的全 部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无 法形成子代噬菌体颗粒。 外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌 落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。
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构建黏粒和噬菌粒的原因和思路
λ-噬菌体载体和M13-噬菌体载体的装载量最大分别为25
kb和1.5kb，装载量无法满足现代基因工程的需要。

在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长
度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包
装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短 载体的长度，又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成
是一类酵母穿梭载体。 ARS1 TRP1 Apr ori TEL BamHI TEL
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YAC具有自主复制
序列、克隆位点以及可在
细菌和酵母菌中选择的标 记基因。此外，YAC还具
pYAC4
EcoRI CEN4
URA3
有酵母菌染色体的一些特
点。可以接受100-1000kb 的外源DNA片段。
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配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色
体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体 载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然 染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。

细菌人造染色体（BAC）

酵母人造染色体（YAC）
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第二节 酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)
②cosmid克隆载体具有质粒的性质。
cosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠
杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转
化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下， 同样也会获得扩增。 cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因， 作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带 上基因插入失活的克隆位点。
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二、 构建cosmid克隆载体的策略
根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者
的这些性质，取长去短，设计由质粒和含有cos位
点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体， 即cosmid克隆载体。
由λDNA片段和pBR322 质粒DNA联合组成的。
cosmid 载 体 ---- pHC79
12
②抗性标记Ampr 。
③ cos位点。有的粘粒载体含
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l fragmen
有2个cos位点。
一、黏粒的结构特征和用途

能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受
体细胞；

能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 重组操作简便，筛选容易； 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小 范围； 不能体内包装，不裂解受体细胞。
第二节 酵母人工染色体载体
这种人工染色体克隆载 ARS1 TRP1
体实际上是一种“穿梭”克
隆载体，含有质粒克隆载体 所必备的第一受体(大肠杆 菌)源质粒复制起始位点 (ori)，还含有第二受体(如 酵母菌)染色体DNA着丝点、 端粒和复制起始位点的序列，
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EcoRI CEN4
Apr
承载大的DNA片段，进行体外包装后能高
效率转导受体细胞 。
使用cosmid克隆载体的程序与使用λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
作为λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分 子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载 体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二 联体线形DNA分子。
写而成的，其原意是
指带cos位点的质粒。
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l fragment
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考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
pHC79

cos序列是l噬菌体DNA
ori
6400 bp
中将DNA包装到噬菌体 颗粒中所需的DNA序列。
外源DNA片段的容量就可以与染色体的大小媲
美。
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人工染色体载体:
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复 制的载体称为人工染色体载体。 模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片 段的DNA片段。
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目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人工染色体载体（BAC） 酵母人工染色体载体（YAC） 黏粒载体（ cosmid ） P1人工染色体载体（PAC）

用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺 陷型互补基因和显性基因两大类

营养缺陷型互补基因 主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因， 如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体 非常困难
抗性选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补
的营养缺陷型。
人工染色体克隆载体的特点： 能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源 DNA片段。
克隆位点 插入失活选择： SUP4酶失活的酵 母菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。 14
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位于 SUP4 基因内部。
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用于转化子筛选的标记基因
限制性核酸内切酶
切割二联体线形DNA分子和部分切割待克隆的外源DNA片段
DNA连接酶
成为可用于体外包装的样品
不管是(a)程序还是(b)程序，最后获得的重组 线形DNA分子必须保留质粒的复制起始位点(ori) 和选择标记基因，保证重组的线形DNA分子导 入受体细胞后，cos末端自行连接环化，按质粒 的性质进行自主复制，并且有效地表达选择标 记基因的产物，供筛选阳性克隆子。
六、 构建cosmid文库应注意哪些问题

①载体分子的自身连接，从而导致效率降低
或者失败。
载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，
因此往往会出现载体同载体自身连接，结果
在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连 在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体 分子自身连接；
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②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一
克隆载体能克隆40kb左右的外源DNA片段。
四、cosmid克隆载体的工作原理
cosmid克隆载体具有质粒克隆载体的性
质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转
化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。
实际上，使用cosmid克隆载体主要利用它 的λ噬菌体克隆载体性质。
因为cosmid克隆载体含有cos位点，可
④构建的cosmid克隆载体较小，因此能承载比较 大的外源DNA片段。 如果cosmid克隆载体的大小为6.5 kb，按入噬
菌体容许包装的量计算，能承载的外源DNA片段
最大可达44.5 kb(即51 kb～6.5 kb)，最小的也有
29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用这样的cosmid
现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯
质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大
片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而
致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。
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人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要
克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段。

将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分
pYAC4
URA3
ori TEL BamHI TEL
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以及合适的选择标记基因。
一、YAC载体的复制元件和标志基因
YAC载体应含有下列元件：
酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 ARS1 EcoRI CEN4
TRP1
Apr ori
pYAC4
酵母染色体的着丝粒序列
酵母系统的选择标记
URA3
大肠杆菌的复制子标记
YAC载体的装载量为
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TEL BamHI TEL 250 - 400 kb
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这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按 质粒复制形式进行高拷贝复制。 这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组 后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内 按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。
筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素
Genetic Engineering
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常规载体在工作时都是在不影响质粒和噬菌
体复制功能的基础上装载外源DNA片段的，同
时保持质粒和噬菌体的基本特性。这样一来，这
些载体所装载的容量就受到限制。
人类、动物、植物的全基因组序列分析往往
需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段， 此时质 粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。