浙大生化实验一
浙大生化实验一
实验报告课程名称： 生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________实验名称： 蔗糖酶的提取及离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 实验类型： 生化实验 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
2、学习离子交换层析的基本原理；3、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；4、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验内容和原理1、酵母细胞破碎本实验采用研磨的方法。
通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。
2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。
本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。
由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。
3、离子交换层析离子交换层析是常用的层析方法之一。
它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
在某一pH 值的专业： 生物科学 姓名： 学号： 日期： 地点：装订线溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
生化大实验——精选推荐
实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。
以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。
两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。
与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。
1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。
然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。
这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。
密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。
颗粒在梯度中移动的快慢。
取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。
在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。
用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
通过这种方法可粗略的分离叶绿体。
浙大生化实验报告氨基转换反应
浙大生化实验报告氨基转换反应实验目的：1. 了解尿素循环和氨基酸代谢的概念。
2. 掌握氨基转换反应的基本原理和方法。
3. 熟悉氨基转换反应的实验步骤和操作技巧。
实验原理：氨基转换反应是将氨基酸中的氨基转化为尿素排除体外的过程。
氨基酸进入肝脏后，通过转氨酶作用，将其氨基转移至α-酮酸中，生成相应的α-氨基酸。
肝细胞内存在尿素循环，即氨酸通过一系列酶的作用，转化为尿素，最后排出体外。
这一过程中，合成尿素的酶有五种，其中肝素合成酶（OTC）是尿素循环的速率限制酶。
在氨基转换反应中，尿素循环起到了重要的作用，通过测定血中尿素和谷草转氨酶（AST）的活性，可以判断肝脏的状态和氨基酸代谢状况。
实验步骤：1. 取适量的血清置于试管中，记录试管编号。
2. 分别在不同的试管中加入不同的试剂：试管A：加入5μl生理盐水。
试管B：加入2μl L-谷氨酰胺。
3. 在每个试管中加入10μl 的反应液，混匀后放置于37℃水浴中反应1小时。
4. 在每个试管中加入40μl 的去离子水，混匀后加入2ml 三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白质。
5. 试管中的混合液混匀后，离心5min，将上清液转移到新的试管中，加入40μl 的1.5%四氯化碳（TCB）、200μl 1%吲哚丙酮、200μl 2.5%氨水，混匀后放置于室温下反应10min。
6. 在每个试管中加入2ml 甲醇，混匀后离心5min。
7. 将上清液转移到新的试管中，加入1ml 1.5%四氯化碳（TCB）。
8. 在每个试管中加入等量的去离子水，混匀后放入比色皿中，使用比色计测定各试管中产生的7-羟-库欣胆酸的吸收值。
实验结果：试管编号反应液产生的7-羟-库欣胆酸吸收值A 生理盐水 X实验分析：通过测定各试管中产生的7-羟-库欣胆酸吸收值，可以判断氨基转换反应的情况，以及肝脏的状态和氨基酸代谢状况。
通过比较试管B和试管C的吸收值，可以得出氨基酸代谢是否正常。
如果试管B的吸收值比试管C高，则说明肝脏合成尿素的能力正常，代谢氨基酸的能力也正常。
生化大实验实验报告
一蛋白质提取、纯化及分析技术实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组200-300g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001m EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m 巯基乙醇，0.001m EDTA，0.005m MgCL2）配置时配。
（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1：粗酶提取：马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001m EDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
2：盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。
沉淀用0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02N KCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
三、实验结果获得PPO粗酶液供上柱使用。
实验二柱层析纯化PPO一、材料与试剂试剂：0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephadex G-200等；实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
浙科版生物选1实验1听写
实验1 大肠杆菌的培养和分离1、进行大肠杆菌的，利用液体培养基进行细菌培养的操作；进行大肠杆菌的，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。
2、大肠杆菌是、的肠道杆菌。
3、是消除污染杂菌的通用方法，也是用于的最简便方法之一。
4、培养基的配置是先调PH再灭菌还是先灭菌再调PH？5、将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用转移带菌的培养物。
6、涂布分离法，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释倍。
取mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上，然后进行培养。
7、划线分离法，；涂布分离法，，但操作复杂些。
8、高压蒸汽灭菌法,一般条件在℃（压力）下灭菌min。
值得注意的是，实验中所需的棉花不能用脱脂棉，原因是。
9、“细菌喜，霉菌喜”，通常细菌培养基要用来配制，还要加入一定量的氯化钠，目的是；霉菌培养基一般用即可。
10、培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用压力（℃以上）灭菌min。
11、玻璃砂漏斗用后需用浸泡，并抽滤去酸，再用洗至洗出液呈中性，干燥后保存。
12、将培养基转移到三角瓶和试管中时，必须用；液体培养基先分装还是先灭菌？13、将有培养基的三角瓶和培养皿放到上，打开超净台的，待固体培养基冷却到℃时，，，然后倒平板。
14、倒平板时，每倒入一个培养皿后立即将培养皿。
15、倒完平板后，可做无菌检查，目的是。
16、扩大培养时，三角瓶在℃，每分钟转的摇床上振荡培养12h17、划线分离时，接种环需在菌液中蘸次，经培养后可看到，表明菌己被分离。
18、在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，先，后置于保存。
19、进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置？20、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？。
浙科版高中生物选修一 第一部分 实验1 大肠杆菌的培养和分离(共15张PPT)精品课件
回忆有关细胞的元素组成、分子 组成的知识，想一想微生物应该生活 在什么环境中呢？
1.平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌 要求：
（1）每四人一组，每组均需完成两种方法； （2）组内成员可任选一种分离方法。 2.培养 将培养皿倒置放在培养箱内，于36℃培养 24h。
课题1 大肠杆菌的培养与分离
思考： 1.为什么培养皿在培养箱内要倒置呢？ 2.菌落是种群吗？
作业： 1.对比实验，说出自己操作过程中的
3.用途：★ ★ ★ ①选择培养基：缺某种物质或多加某种物质 ②鉴别培养基：加指示剂或化学药品
月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤
（LST）
配置培养基：
溶化（溶解）
分装
倒平板：
倒平板：
接种：
接种针灼烧灭菌
平板划线
大肠杆菌的纯化方法：
稀释涂布平板法
平板划线法
大肠杆菌的分离纯化
——结晶紫中性红胆盐琼脂
不足； 2.简述实验操作注意事项； 3.通过实验注意事项完善实验设计。
每个人都会有自己的特长。一个人做某些事会比其他事做的更好。但许多人从未找到最适合自己的事情，其根本原因往往是他们没有进 果你对一切都随遇而安，那总是会有一天你会后悔莫及的。心，只有一颗，不要装的太多。人，只有一生，不要追逐的太累。心灵的愉 有；简单的快乐，来自心态的知足。家，很平淡，只要每天都能看见亲人的笑脸，就是幸福的展现。爱，很简单，只要每天都会彼此挂 暖。幸福并不缥缈，在于心的感受。爱并不遥远，在于两心知的默契。人与人之间，尊重是相互的，心与心相交，尊重是必须的，尊重 体现在做人做事，尊重，是一个人的人品尊重，让人与人走近。人无所舍，必无所成。心无所依，必无所获。自己的路只有自己去走， 去度。能抓住希望的只有自己，能放弃自己的也只有自己。能怨恨嫉妒的是自己，能智慧温暖的还是自己。心中有岸，才会有渡口，心 安然。每个人都会有自己的想法、做法、活法。理念不同，做法不同，活法就不同，我们没必要去干涉别人，影响别人，甚至攻击别人 不会报复；他不好，不去打击，不去鄙视。人人都有自尊，人人都有苦衷，生活中没有谁，不希望自己活得更好，走得更顺。学会理解 一个优秀的人，都有一段苦逼的时光。或许是因为一份学业，一份工作，一段爱情，离开了爸爸妈妈，去了一座别的城市。当你倦了厌 母正在为你打拼，这就是你必须坚强的理由。不管发生什么，记住不是只有你一个人在努力不要轻易放弃。一个人在外面，很不容易， 强！每一个闪光的人，都在不为人知的地方默默努力。穿越孤独，战胜恐惧，完善自己。可以流泪，可以休憩，可以抱怨，但绝不放弃 圆缺，都会途经，也都将过去。内心的宁静，是最有力量的修行。佛说，人的痛苦，源于追求了错误的东西。常常，我们苦苦的追逐， 殊不知，有些不甘放下的，往往不是值得争取的，有些苦苦追逐的，往往不是生命需要的。我们要做的是让心静下来，心静下来才知道 什么，让心静下来，静观自在。人，要么像辣椒一样有脾气。要么像白菜一样有层次。要么像莲藕一样有心眼。可我做不到！我就像一 拐弯抹角，一就是一，二就是二。虽然这样的性格吃不开，容易得罪人，但我还是喜欢这样的自己，不虚伪，不算计别人，喜欢做真实 人有傻福。人的善良一定要有底线，大度要讲原则，道德讲底线。你不发脾气，别人就以为你没脾气，你不争取，别人就会占尽你的便 机，也不要活得太单纯。不要别人跟你说几句好听的，你就不管不顾地对人家好，到头来辜负了自己的一片好意。生活是自己的，你的 乐，都得靠自己去感受，去捕捉。改变别人是事倍功半，改变自己是事半功倍。相信自己，美好的生活从改变自己开始！自信，是走向 胜困难的利剑，是达向理想彼岸的舟楫。有了它，就迈出了成功的第一步；有了它，就走上了义无反顾的追求路。诚信是人最美丽的外 的鲜花。人有见识，就不轻易发怒。宽恕人的过失，便是自己的荣耀。青春赚的钱，难赚回青春；生命赚的钱，难买回生命；幸福换来 爱情索取的钱，难索回爱情；时间挣来的钱，难挣回时间。即使用一生得到全世界的钱，全世界的钱也买不回你的一生，请记住金钱不 的时候要休息，该放松的时候要放松，快乐生活才是最给力的。人这一辈子，不可能事事如人意，遇到困难和烦心的事情；要学会自己 快乐的心境和乐观的心态。前行路上，遇见烦恼的时候，不妨学说三句话，第一句话：“算了吧”；第二句话：“不要紧”；第三句话 的”。没有过不去的事情，只有过不去的心情；心若晴朗，人生便没有雨天。别人拥有的，不必羡慕；只要努力，时间都会给你。总想 者必赢。令狐冲说：“有些事情本身我们无法控制，只好控制自己。”考前两个月就是冲刺。养兵千日，用兵一时更快、更高、更强。 的母亲是失败，成功的父亲是汗水面对目标，信心百倍，人生能有几次搏？面对成绩，心胸豁达，条条大陆通罗马。如果敌人让你生气 胜他的把握，如果朋友让你生气，那说明你仍然在意他的友情高考试卷是一把刻度不均匀的尺子：对于你自己来说，难题的分值不一定 平线留给世界的就只能是背影 。没有平日的失败，就没有最终的成功。重要的是分析失败原因并吸取教训。能冲刷一切的除了眼泪，就 推移感情，时间越长，冲突越淡，仿佛不断稀释的茶。不怕考不上，就怕不敢考。积一时之跬步，臻千里之遥程在冷峻的雪山上很多朝 学习与坐禅相似，须有一颗恒心。时间太瘦，指缝太宽调节好兴奋期，学习一浪高一浪名列前茅是银，日新月异是金怨言是上天得至人 是人类祷告中最真诚的部分不必每分钟都学习，但求学习中每分钟都有收获人非要经历一番不同平时的劫难才能脱胎换骨，成为真正能 须咬牙厉志，蓄其气而长其志，切不可恭然自馁也生活比电影狠多了，从来不给弱者安排大逆转的情节。即使赚得了全世界，却失去了 义呢？不要把时间、财力和劳动，浪费在空洞多余的话语上。永远以用心乐观的心态去拓展自我和身外的世界。人的一生，有许多事情 慢慢回味的，过去的就莫要追悔，一切向前看吧 任何打击都不足以成为你堕落的借口，即使你改变不了这个世界，你却依然可以改变自 路永远走下去。不肯下一点功夫，永远不会明白自己从何而来，又将立足于何处。. 凡事不要想得太复杂，手握的太紧，东西会碎，手 路，走的人多了，也便成了路。通过云端的道路，只亲吻攀登者的足迹。不是每个人都适合与你白头偕老。有的人是拿来成长的，有的 有的人是拿来一辈子怀念的。闪光的未必都是金子，而沉默的也不一定就是石头。世界上那些最轻易的事情中，拖延时间最不费力。每 为了让远方变得更近一些。你多学一样本事，就少说一句求人的话。我们是如何一步步落后于别人的，自己心里特别清楚，无非是从生 开始的。人在千里，家在心里；家在千里，人在心里。只有创造，才是真正的享受，只有拚搏，才是充实的生活。 世上真正厉害的 不 牌，而是哪怕你拿到的是一副差牌，也能赢得胜利！别抱怨生活的无聊生活嘛，就是无聊中自己找些乐子。我可以被打败但我不允许自 聪明人之所以没有成功，缺少的不是智慧，而是那种为成功而拼搏的干劲 成功不是将来才有的，而是从决定去做的那一刻起，持续累 怀，让是一种修养，退、让则是一种智慧。所谓天才，只不过是把别人喝咖啡的功夫都用在工作上了。善于利用零星时间的人，才会做 现实会告诉你 不努力就会被生活踩死，无需找什么借口，一无所有 就是拼的理由。靠山山会倒，靠水水会流，靠自己永远不 精诚所至 坎坎坷坷，跌跌撞撞那是在所难免。但是，不论跌了多少次，你都要坚强地再次站起来。任何时候，无论你面临着生命的何等困惑，抑 无论道路如何的艰难，无论希望变得如何渺茫，请你不要绝望，再试一次，成功一定属于你一个家庭没有书，就好像一间房子没有窗户 和快乐看作是生活目的的本身。手指有长有短，知识有高有低。学无前后，达者为师。任何不能打倒你的，将会使你更加坚强。如果你
浙江大学生物化学实验甲SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定蛋白质的分子量
• 这样的蛋白质- SDS复合物在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒 的长度，也就是蛋白质分子量的函数。
• 当蛋白质的分子量在15000~200000D之间时，蛋白 质分子的电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系， 符合下列方程式：
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定蛋白质的分子量
1.1、原理
• 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各 蛋白质组分的分子大小和形状以及所带静电荷的多 少等因素所造成的电泳迁移率的差别。蛋白质分子 在外加电场下的泳动行为可用下列函数式表示：
EQ V=
6π rη
v：分子泳动速度
E：电场强度
η ：介质粘度
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定蛋白质的分子量
• 自由基引发的方式有化学法和光化学法两种，前者 的引发剂是过硫酸胺（AP），后者的引发剂是核 黄素（VitB2）。两种方法的催化剂都是四甲基乙 二胺（TEMED）。
• 在一定浓度范围内，改变聚合体系中Acr和Bis的比 例，可得到不同网眼大小的凝胶，由于凝胶的三维 网状结构，对在凝胶中泳动的不同分子量的质点有 着选择和阻碍，因此使凝胶本身又具有分子筛效应。
称取去脉叶片0.5g，加入0.05mol/L pH7.8的磷酸缓 冲液2ml，加石英砂少许研磨成匀浆，10000r/min 离心10min，上清备用。 ⑵、样品的处理 • 取30ul待测样品的上清于离心管中，加入30ul浓样 品溶解液，混匀，置于100℃水浴中保温3~5min， 取出冷却备用。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定蛋白质的分子量
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定蛋白质的分子量
• 如将已知分子量的几种标准蛋白质的相对迁移率对 分子量作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在 相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在 标准曲线上求得该蛋白质的分子量。
浙大微生物大实验报告
浙大微生物大实验报告摘要：本实验以土壤中的微生物作为原材料，根据微生物各自的生长特点，配制不同成分的微生物培养基。
将微生物培养物或含有微生物的样品在无菌条件下移植到培养基上培养，在分离出相应微生物后，对其进行进一步的纯化，然后观察其形态特征，并通过微生物的生理生化反应对其种类进行鉴定，最后研究环境条件对微生物生长的影响。
关键字：培养基，分离，纯化，鉴定，环境条件一、实验材料1、分离细菌、真菌、放线菌的材料：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O等。
新鲜土壤；培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（10mL装）；试剂：5000U/mL 链霉素液、0.5％重铅酸钾液。
2、细菌、真菌、放线菌纯化与鉴定的材料：菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌，前实验分离的未知菌；培养基：淀粉培养基、硫化氢实验培养基、石蕊牛乳培养基、油脂培养基；试剂：碘液。
菌种：枯草杆菌斜面；灵杆菌菌液；黑曲霉斜面。
培养基采用：牛肉膏蛋白胨斜面培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（10mL）、马铃薯蔗糖培养基（10mL）、淀粉琼脂培养基（10mL）；供试药剂：2.5％碘酒，75％酒精，0.1％HgCl，5％石炭酸。
2二、实验步骤1、分离细菌、真菌、放线菌的步骤（一）、培养基配制l. 培养基配制的一般方法和步骤（1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。
（2）溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（根据实验需要加入蒸馏水或自来水），用玻棒搅匀，加热溶解。
（3）调pH值（调pH也可以在加琼脂后再调），用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。
（4）加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。
浙江大学生物化学实验甲奥赛质粒DNA的小批量提取与酶切鉴定-文档资料
3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理
• 核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在 pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动， 根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构 型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴 定。
反应体系
ddH2O
10×buffer DNA 酶
10 ul 用水补足到10 ul
1 ul
0.1ug 1U
20 ul 用水补足到20 ul
2 ul
0.5ug 5U
50 ul 用水补足到50 ul
5 ul
1ug 10U
2、反应条件 • 反应时间：1~2小时，一般1.5小时。 • 可加入过量的酶以缩短反应时间。 • 对于许多酶，都可以用更少单位的酶消化 16小时。 • 反应温度：一般37℃，但应注意因酶而异。
• 限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物中，1970 年 由 H.O.Smith 等 从 流 感 嗜 血 菌 中 最 先 分 离 得 到 。 现已发现近几百种(498种)。
• 该类酶能识别DNA分子中的特异序列，并在此序 列处切断DNA双链。
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
• 绝大多数限制性内切酶的识别序列为4个~6个碱基 对，该序列具回文对称结构，且富含GC。（即旋 转1800后与原来结构相同），少数酶可识别更长 的序列或兼并序列。
下层：酚，氯仿
离心
中层：变性蛋白 上清（水层）：质粒DNA、RNA等 无水乙醇
离心 上清：可溶性杂质等
沉淀：质粒DNA、RNA等 RNase 质粒DNA
（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定
浙江大学生物化学实验甲不同植物SOD提取及活力测定
不同植物SOD提取及活力测定
核黄素，TEMED ．
O2
光照
O2
． 光照 NBT + O2
还原剂
甲（qian） 蓝色，560nm处具特征光吸收， OD值与 O2 含量．成正比。
．
NBT + O2
SOD 光照
抑制反应
抑制原因：
．
O2
+
．
O2 +
2H+
SOD
H2O2 +
O2
SOD对NBT光化还原的抑制程度与SOD活性成正比，
不同植物SOD提取及活力测定
1、SOD简介
• 超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于动、植
物和微生物中的金属蛋白酶，是一种重要的抗氧化
剂，可清除自由基，其清除自由基的反应如下：
．
．
O2 + O2 + 2H+
SOD
H2O2 + O2
• 生物体在长期的生命活动中，常常会因为环境因素
或生理条件的变化而出现氧自由基增加、抗氧化能
（二）SOD同工酶活性染色
• Cu、Zn-SOD则一般是由两个相同的亚基组成的二 聚体，每个亚基的分子量约为16000D，含一个铜原 子及一个锌原子，不同来源的Cu、Zn-SOD其一级 结构的同源性也很高。
2、SOD同工酶活性染色原理
• 由于三种SOD同工酶的分子量和电荷间存在差异， 因此可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法将三种SOD同工 酶分开。
（二）SOD同工酶活性染色
3、材料与试剂
• 试验材料：新鲜植物叶片。 • 试验试剂：详见P117。
4、操作方法
• 各步操作方法及注意事项解说详见P118。
浙大生化实验报告DNA的提取
实验报告课程名称： 生化实验甲 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称：植物基因组DNA 的提取 实验类型： 生化定性实验 同组学生姓名： 及纯度与含量的测定 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握植物基因组DNA 的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA 结果的初步分析； 4、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA 纯度与含量的方法。
二、实验基本原理 植物基因组DNA 的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基硫酸钠 (SDS)法。
十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA 得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA 、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA 溶于TE 溶液中，即得植物基因组 DNA 溶液。
由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA 降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA 聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。
传统的CTAB-DNA 提取法步骤多，较烦琐，DNA 产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。
SDS 法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA ，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响DNA 的限制性核酸内切酶酶切效果。
由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
浙江大学大化o实验理论考复习整理
大化o实验复习一、简单蒸馏&减压蒸馏沸点：101.325kPa，760mmHg，一个大气压下的沸腾温度。
液体沸点范围可代表其纯度。
蒸馏法需各组分沸点相差30°C以上才得到好的分离效果。
*蒸馏装置：热源，蒸馏瓶，温度计，冷凝管，接液管五部分。
蒸馏物体积是蒸馏瓶容积的1/3-2/3。
液体沸点高于140°C用空气冷凝管，低于140°C用直形冷凝管。
**蒸馏低沸点易燃气体，用带支管的接液头，支管接橡皮管通下水道。
玻璃仪器接口要严密，要蒸馏系统不可密闭，尾接管侧口保持开放。
前馏分：到沸点前，有沸点较低的液体先蒸出。
蒸馏速度以每秒挣出1-2滴为宜。
分馏可将沸点相差1-2°C混合物分开。
**回流比：单位时间内由柱顶冷凝返回柱中液体数量与蒸出量的比。
回流比大分馏效果好，但耗时长且样品损失大。
使用减压蒸馏：沸点较高的有机物至沸点前就发生分解氧化等反应。
沸点与压力相关：lgP=A+B/T。
压力降到10-15mmHg，每加1mmHg，沸点升高1°C。
毛细管（离管低1-2mm)：空气从毛细管进入烧瓶，成为液体沸腾汽化中心，并且搅拌作用。
瓶内液体不超过容积的1/2。
接收器选择能耐外压的蒸馏烧瓶。
不可用沸石、气泡会集中从沸石上冒出。
【毛细管作用已代替沸石】打开或关闭真空泵时，一定要使安全评活塞处处于打开状态。
冷却陷：防止压力计水银被污染。
**循环水泵：10mmHg 油泵：2-4mmHgCaCl2：去除气体中的水。
NaOH：去除酸性气体，防止腐蚀抽气机。
固体石腊：可以降低抽气机油的饱和蒸气压，提高抽气能力。
二、糖类旋光度的测定测旋光度：[α]tλ=α/(cL)，别忘了单位°【每100ml含1g旋光性物质的溶液在1dm样品管中得旋光度】旋光度作用：1、通过测定值和文献值对比，检查旋光性物质的纯度和含量2、研究旋光性物质的反应机理。
测定旋光性物质的反应速率常数等。
浙江大学生化实验报告
浙江大学生化实验报告1.引言1.1 概述概述部分：本实验旨在对浙江大学生化实验进行系统的记录与分析，通过实验结果展现实验的过程和成果，并对实验的意义和未来的发展进行展望。
该实验采用了一系列生化实验方法，旨在研究生物体内生化反应的机制和规律，为生物医学领域的研究和发展提供有力支持。
通过对实验背景、方法和结果的详细描述，本报告旨在为读者提供全面的实验信息，让读者更加深入地了解实验的过程和意义。
1.2 文章结构文章结构部分的内容应该包括对整篇文章的章节安排和内容概要的介绍。
可以简要描述每个章节的主题和重点，以便读者可以更好地理解整篇文章的结构和内容安排。
例如："文章结构部分将主要介绍本篇文章的整体结构和各个章节的主要内容，以便读者可以更好地理解全文的脉络。
引言部分将从概述、文章结构和目的三个方面介绍本篇文章的主题和写作目的。
正文部分将包括实验背景、实验方法和实验结果三个部分，分别介绍了实验的背景知识、实验的具体操作步骤以及实验结果的分析和讨论。
结论部分将对实验结果进行深入分析和总结，并展望未来可能的研究方向和发展趋势。
通过整体的文章结构，读者将更清晰地了解本篇文章的内容安排和逻辑脉络。
"1.3 目的：本次实验旨在探究特定生化反应的机理和影响因素，通过实验的进行，旨在深入了解该生化反应的特性和规律，从而为相关领域的研究和应用提供理论和实验基础。
同时，通过实验的设计和操作，培养学生的实验操作能力和科学思维，提高他们的实践能力和动手能力。
通过实验结果的分析和总结，使学生们对生化实验有一个更深入的理解和认识，为未来的学习和研究打下坚实的基础。
2.正文2.1 实验背景本次实验旨在探究生化领域相关的实验内容，通过对生物组织、酶活性、代谢途径等方面进行深入研究，加深对生化学原理的理解和掌握。
生化实验既是理论知识的延伸，也是对知识的实践检验，对于培养学生的实验操作能力和科学研究能力具有重要意义。
实验背景包括对常见的生化实验技术和实验原理的介绍，例如酶活性检测方法、代谢途径的测定方法等。
浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备、纯化步骤-离子交换
酵母蔗糖酶的制备一、酵母蔗糖酶的制备1.缓冲液抽提称取10克干酵母粉，加3克石英砂，于研钵中研磨约2分钟；再加30毫升0.02 mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液（以6毫升1份分次加），边加边研磨至成浆状，将匀浆转移到50ml 离心管中，于8000转/分离心20分钟，形成三层；用滴管插入取水层（中层）于50ml离心管中，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中，量体积，记为F1。
留0.5毫升以测定酶活力和蛋白质含量（Fraction I），其余转入50ml离心管中用于加热纯化。
2. 加热纯化将上清液置于50℃水浴中保温30分钟，随时摇动；然后于冰—水浴中冷却，以10000转/分离心10分钟，取上清液到量筒中，量体积，记为F2。
留0.5毫升测酶活力及蛋白质含量（Fraction Ⅱ）。
其余用于醇分级分离。
3. 醇分级分离于上清液中加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，冰上进行，慢慢滴加，边滴边摇（控制在6-8分钟加完）。
充分混匀后，于冰-水浴中放置20分钟；以10000转/分离心10分钟，取沉淀，用4-5毫升0.05mol/L、pH7.3的Tris-HCl缓冲液（含0.025mol/LNaCl）溶解沉淀，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中量体积，记为F3。
留1毫升测酶活力及蛋白质含量（FractionⅢ），其余用于柱层析。
样品保存于冰箱中备用。
4.DEAE-Sepharose柱层析分离纯化柱规格：1×20（cm，直径）流速：3ml/10min上清（约3~4ml）加到DEAE-Sepharose柱上进一步分离纯化。
流速3ml/10min，洗脱液：0.02 mol/L pH7.4的Tris-HCl，在0～1mol/L NaCl下进行线性梯度洗脱，收集：3ml /管。
二、各步提取液蛋白质含量的测定1. 蛋白质含量标准曲线的制作项目试管号0 1 2 3 4 5蛋白质含量（μg）/ 50 100 150 200 250蛋白质标准液（ml）/ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0无离子水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 /Follin酚甲液（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀，于室温（20~25℃）放置10分钟Follin酚乙液（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5充分混匀，于30℃水浴保温30分钟OD650（nm）蛋白质标准液浓度：250ug/ml2. 各步提取液蛋白质含量测定(已预热到37℃)项 目 试管号空白 Fraction Ⅰ（1：10） Ⅱ（1：5） Ⅲ（1：2）1 2 3 4 5 6 7 稀释酶液（ml ） 0 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 无离子水（ml ） 1.0 0.9 0.8 0.9 0.8 0.9 0.8 Follin-酚甲液（ml ） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀，于室温放置10分钟 Follin-酚乙液（ml ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀，于30℃水浴保温30分钟OD 650nm蛋白质含量（μg ） 平均值（μg ）提取液蛋白质总含量（mg ）三、各步提取液酶总活力及比活力测定1. 葡萄糖标准曲线的制作 项目 试管号0 12 3 4 5 6 8含糖量（）葡萄糖标准液（ml ） / 0.1 0.20.3 0.40.5 0.6 0.7无离子水（ml ） 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 DNS 试剂（ml ） 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8混匀，于100℃水浴中保温5分钟，取出经流动水冷却后，再加5ml 蒸馏水，混匀。
浙大生化实验报告氨基转换反应
实验报告课程名称：生化实验甲 指导老师： 成绩：__________________实验名称： 氨基移换反应及其产物的鉴定 实验类型： 同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；2、学习纸层析的原理和操作技术。
二、实验基本原理 1.氨基移换反应：在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。
转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。
转氨酶的最适pH 接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT ）和谷草转氨酶（GOT ）的活性最强。
转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。
在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase, GPT ）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT ）活性较高。
GPT 催化下的转氨基反应为：L －谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L －谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L －谷氨酸。
本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。
2. 纸层析原理：滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。
利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。
层析溶剂是由有机溶剂和水组成。
滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。
进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。
浙江中医药生化大实验题库
浙江中医药生化大实验题库复习参考资料：1、生物化学的实验技术有哪些?1、①离心技术②层析技术③电泳技术④免疫化学技术⑤分光光度技术⑥高效液相技术 3、什么是离心力? 什么是相对离心力? 各用什么表示?3、 1 〕离心力(centrifugal force，Fc) 离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。
离心力(Fc)的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积。
2 〕相对离心力(relative centrifugal force，RCF)就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
4、制备性离心机可分为几类,表达每类的特点？ 4、制备性离心机可分为三类：⑴普通离心机：最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000×g，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。
⑵高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm〔r/min〕，最大相对离心力为89000×g，用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的别离纯化工作。
⑶超速离心机：转速可达50000～80000 rpm，相对离心力最大可达510000×g，它能使亚细胞器得到分级别离，还可以别离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。
5、转头可分为几类,每类的特点是什么? 5、转头：⑴角式转头：角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。
它是由一块完整的金属制成的，其上有4～12个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20～40度之间，角度越大沉降越结实，别离效果越好。
这种转头的优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应〞，壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响别离效果。
⑵荡平式转头：这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶〔离心套管〕构成。
浙科版选修1生物实验一：大肠杆菌的培养与分离ppt上课版25张
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2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量 稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.
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3.在作第二次以及其后的划线操作时，为 什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起 始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
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实验1 大肠杆菌的培养与分离
一、培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离
封口膜：既通气 又不使菌进入
二、倒平板
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培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来倒平板
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭
大一生化试验8个
一酵母RNA提取分离及组分鉴定一.实验目的①掌握和学习使用离心机②掌握RNA提取分离方法及其鉴定方法③了解核酸组分二.实验原理①RNA溶于碱性溶液②加入酸性乙醇可使RNA沉淀③RNA可水解为含氮碱基、戊糖、磷酸三.实验材料与器材酵母片研钵、25ml试管一支、普通试管三支、烧杯、离心管、玻璃棒、恒温水浴锅、量筒、移液管、分析天平、试管架四.实验步骤5片酵母片一加10mlNaoH研磨(25ml试管)一沸水浴30min T离心15min(3000r/min),之后将上清液注入15ml酸性乙醇中，边到边摇，之后将其离心3min,弃上清液，然后用95%乙醇15ml洗涤一次，离心3min,弃上清液得RNA粗制品，加入6ml H2so4,沸水浴加热10min五.鉴定①嘌吟鉴定：向试管中先加入1mlAgNo3,再加入1ml氨水形成絮状物，最后加入水解液1ml②磷酸鉴定：先加入定磷试剂1ml,再加入水解液并加热溶液变为蓝色六.结果与分析酵母RNA中含有碱基和磷酸二考马斯亮蓝G “测定蛋白质含量25U一.实验目的①掌握分光光度计的使用方法②理解和掌握考马斯亮蓝法测蛋白质含量的操作二.实验原理G250游离态呈红色，与蛋白质结合后变蓝色在595nm有最大吸收值三.实验器材与试剂绿豆芽下胚轴、考马斯亮蓝G250、95%乙醇、85%磷酸、分光光度计、漏斗、滤纸、试管架与试管、微量移液器、研钵、封口膜四.实验步骤①标准曲线的绘制C(ug/ml)=118.25*A+0.2799,A=(A1+A2)/2②取新鲜绿豆芽下胚轴0.5g左右，放入研钵中加入5ml蒸馏水研磨至匀浆，再加入5ml水摇匀，过滤至大试管③取三支试管按下表加入溶液，混匀，等2min④在2=595nm处测样品吸光值五.计算样品含量=(CV)/W ug/g注：V=25ml,W=0.5g左右(自己测的多少是多少)三小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一.实验目的①熟练掌握分光光度计的原理和使用方法；②学习测定淀粉酶活力的方法③了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化二.实验原理种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在，淀粉酶使之分解为麦芽糖，麦芽糖有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸可用分光光度计法测定。
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.. 实验报告课程名称： 生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________实验名称： 蔗糖酶的提取及离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 实验类型： 生化实验 同组学生：一、实验目的和要求（必填） 二、实验容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
2、学习离子交换层析的基本原理；3、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；4、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验容和原理1、酵母细胞破碎本实验采用研磨的方法。
通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。
2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。
本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。
由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。
3、离子交换层析离子交换层析是常用的层析方法之一。
它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
在某一pH 值的溶专业： 生物科学姓名：学号：日期：地点： 装订线液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
4、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶是一种水解酶。
它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。
还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水酸法，其原理是3.5－二硝基水酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定围还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用 3.5－二硝基水酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。
三、实验材料与试剂1、实验材料市售干酵母粉 10g/组，蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ2、实验试剂1、石英砂；2、95% 乙醇(-20℃）；3、DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)；4、20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；5、20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液；6、0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ；7、5%蔗糖溶液；8、3，5-二硝基水酸试剂四、实验器材与仪器1、电子天平（称量样品）；2、研砵（每组一套）；3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；4、托盘天平（离心管平衡用）；5、高速冷冻离心机；6、恒温水浴箱；7、制冰机；8、1.5ml离心管；9、－20℃冰箱；10、层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）；11、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1台/组）；12、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/组）；13、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）（1台/组）；14、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）（1台/组）；15、部分收集器及收集试管（1台/组）；16、铁架台、夹子（固定层析柱用）（1套/组）；17、－20℃冰箱；18、试管、试管架等。
五、操作方法和实验步骤1、酵母细胞破碎称取市售干酵母粉10g，约3-5 g石英砂放入研钵中直接干燥充分研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积30-40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵研磨10分钟，使呈糊状液体（研磨越彻底，释放出的蔗糖酶越多）；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟（这次离心分离掉酵母碎片和酵母），收集上清液并量出体积V1（样品I）,另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析。
2、热处理：将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液（由于蔗糖酶相对耐热，热处理能除去很多不耐热的杂蛋白），保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min离心15分钟（由于离心过程会产生热量，故保持4℃一方面保证样品不被破坏，另一方面保护离心机不因过热而损坏），收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。
3、有机溶剂（乙醇）沉淀：将热处理后的上清液逐滴加入相同体积的－20℃的95%乙醇（酒精除去水膜令蛋白沉淀，但由于乙醇会使蛋白局部变形且在4℃以上时可使大部分蛋白完全变性，故保持4℃以下减少变性造成的损失），冰浴中温和搅动混匀，至少放置20分钟，然后转移至两支50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存。
4、离子交换剂准备：(实验室已准备好）5、样品处理：将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于15ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；4℃15000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体积(ml数），取4ml进行分离，其余置于5ml离心管中并放入－20℃冰箱。
6、纯化检测仪器连接：将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝），恒流泵 (10rpm) （流速0.8～1ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5 ml/管/5min）等连接并设置好。
7、装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡：装柱前先调好流速5ml/10min ，然后将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱至层析柱上端。
注意不能带进气泡，待凝胶自然沉积离柱管上端约1-2cm后松开层析柱出口，控制流速 5ml/10min；待柱DEAE —Sepharose Fast Flow 凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（这时须保持DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。
用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。
8、加样：停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。
待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。
用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。
打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。
9、洗脱：梯度洗脱法：加样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为5ml/10min ，洗去未被DEAE —Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液NaCl梯度洗脱（浓度为0-1mol/L NaCl ），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液和50ml含1mol/L NaCl的0.05ml/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
洗脱流速为5ml/10min ，每5ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。
将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品Ⅳ），样品－20℃低温保存备用。
10、蔗糖酶活力检测：收集活力高的蔗糖酶液，测总体积(ml数) （样品Ⅳ），-20℃保存六、实验数据记录和处理1.、V1=22.5ml，V2=18.5ml，V3=6.5ml，2、核酸蛋白检测仪波形图其中，从左至右第一个峰并未检测出蔗糖酶，第二个大峰所在处收集的溶液检测出蔗糖酶，故收集第二个大峰对应的试管里面的液体。
七、实验结果与分析由图1、图2曲线的不同分布可以看出：当蛋白质含量最高时，蔗糖酶的含量并非最高。
这说明在样品Ⅱ中存在其他蛋白质类的杂质。
试管号为7、8、9（即F4-7、F4-8、 F4-9）对应的样品中蔗糖酶的含量相对较高，可知需保存这三管试样进行之后的实验。
八、讨论、心得1、实验操作过程中应小心注意，切勿打翻样品液；2、装柱时应小心不带入气泡，否则需重新装柱；3、层析时应控制液体流速，以免过快导致所得样品液杂蛋白含量过高。