革兰氏染色试验步骤
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
细菌革兰氏染色实验报告
细菌革兰氏染色实验报告细菌革兰氏染色实验报告一、实验目的1.掌握革兰氏染色的方法2.熟悉细菌涂片的制备3.革兰氏染色法进行细菌鉴定二、实验材料1.实验仪器显微镜、酒精灯、载玻片、擦镜纸、接种环,接种针,、试管架、镊子、载玻片夹子、滤纸、滴管2.实验试剂草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番红复染液、无菌水,蒸馏水,、香柏油、二甲苯三、方法与步骤1.操作方法示意图,干燥, ,水, ,水, ,水, ,晾干, 制片——初染———媒染———脱色———复染——镜检 2.操作步骤,步骤一,涂片的制作(1) 涂片载玻片一张,加一滴生理盐水,取菌研磨均匀 (2) 干燥温室干燥,或置酒精灯高处慢慢烘烤(3) 固定干燥后的涂片,在酒精灯火焰中通过3次步骤,二,初染,滴加草氨酸结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色1—2min,后倾去染液,水洗至流出水无色步骤,三,媒染,先用碘液冲去残留水迹,在用碘液覆盖1min,倾去碘液,水洗至流出水无色步骤,四,脱色,将玻片上残留水用吸水纸吸去,在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色,一般20——30s,,当流出液无色时立即用水洗去乙醇。
步骤,五,复染,将玻片上残留水用吸水纸吸去,用番红复染液染色2min ,水洗,吸去残水晾干。
步骤,六,镜检,像涂片涂菌部位滴加适量香柏油,进行油镜观察【小结】1. 选用活跃生长期长的菌种染色,老龄的革兰氏阳性菌会被染成红色,造成假阴性。
2. 涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性3. 脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够,造成假阳性,脱色过度造成假阴性。
4. 染色原理C+菌,胞壁厚,肽聚糖网状分子形成一种透性障,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,故保留结晶紫—碘复合物在细胞膜上呈紫色 C-菌,肽聚糖层薄,交联松散,乙醇脱色不能使其结构收缩,其脂含量高,乙醇将脂溶解,缝隙加大,结晶紫—碘复合物溶出细胞壁,沙皇复染后呈红色。
【注意事项】1. 加热时使用载玻片及试管夹,以免烫伤。
革兰氏染色步骤6则
革兰氏染色步骤6则以下是网友分享的关于革兰氏染色步骤的资料6篇，希望对您有所帮助，就爱阅读感谢您的支持。
革兰氏染色步骤（1）革兰氏染色步骤步骤革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1、涂片固定。
2、草酸铵结晶紫染1分钟。
3、自来水冲洗。
4、加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5、水洗，用吸水纸吸去水分。
6、加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
7、蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。
干燥，镜检。
染色后，革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。
细菌分类：革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。
革兰氏染色法的步骤（2）详细阐叙革兰氏染色法的步骤浏览次数：174次悬赏分：0 | 解决时间：2011-5-25 17:44 |提问者：肖箫2011shaw最佳答案革兰氏染色一、目的：在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
二、原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
革兰氏染色的原理流程及颜色反应
革兰氏染色的原理流程及颜色反应下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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革兰氏染色法步骤及注意事项
1. 准备细菌涂片：将待染菌株取一小滴放在玻璃片上，用铅笔头部画成细 线，形成细菌涂片。
2. 固定：将细菌涂片在火焰上反面向上加热，使细菌附着在玻璃片上。 3. 染色： a. 涂上紫晶液：将细菌涂片浸入紫晶液中，静置 1 分钟。 b. 冲
1. 操作环境应保持干净，并采取无菌操作，以避免外界细菌污染。 2. 手套、眼镜和实验室外套是必需的个人防护装备。
3. 严格遵守安全操作规程，如避免将染料接触到皮肤或进入口鼻。
4. 使用优质的试剂和试验器材，以确保结果的准确性。
5. 注意控制染Βιβλιοθήκη 时间和冲洗时间，过长或过短都可能影响染色效果。
6. 在观察细菌涂片时，使用适当的显微镜镜头和光源，以获得清晰的图 像。
洗：用蒸馏水或脱离水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的紫晶液。 c. 酒 精洗涤：滴加酒精洗涤玻璃片，使其被酒精覆盖，持续洗涤 15-30 秒。 d. 再次冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除酒精。 e. 涂上碘液： 滴加碘液覆盖细菌涂片，静置 1 分钟。 f. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃 片，以去除多余的碘液。 g. 酒精洗涤：滴加酒精洗涤玻璃片，使其被 酒精覆盖，持续洗涤 15-30 秒。 h. 再次冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃 片，以去除酒精。 i. 涂上脱色剂：滴加脱色剂覆盖细菌涂片，持续涂覆 15-30 秒。 j. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除脱色剂。 4. 染色：将细菌涂片滴上红色染料（如苏丹三染料）覆盖细菌，静置 1 分 钟。 5. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的染料。 6. 干燥：将细菌涂片放在通风处晾干，或用吹风机低温吹干。 7. 观察：将干燥的细菌涂片放在显微镜下观察，细菌将呈现出紫色或蓝色 的革兰氏阳性颜色，而其他微生物将呈现出红色的革兰氏阴性颜色。 注意事项：
革兰氏染色法的过程及原理
革兰氏染色法的过程及原理革兰氏染色法是一种用于细菌分类和鉴定的重要染色方法。
该方法由丹麦细菌学家克里斯汀·革兰发现并发展起来，于1884年首次发布。
革兰氏染色法能够将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，具有重要的临床和实验室应用价值。
染色：将待检测的细菌接种于玻璃片上，用火焰烘烤杀灭细菌并固定在玻璃片上。
接着，将玻璃片放入甲醇中，用火焰加热将甲醇蒸发。
然后，将玻璃片浸泡在革兰之前的染色液中，染色液由紫色的亚甲基紫和碘化钾组成。
这一步骤的目的是通过紫色染料使细菌固定在玻璃片上。
洗涤：将玻璃片放入碘化钾溶液中洗涤。
碘化钾能与细菌细胞壁上的一些成分形成复合物，使细菌呈现蓝色。
固定：将玻璃片放入醇中洗涤。
醇有助于将紫色染料从革兰阴性菌的细胞壁中洗去。
显微观察：将玻璃片放入显微镜下观察。
在显微镜下，革兰阳性菌呈现紫色，而革兰阴性菌呈现红色。
根据这一特征，可以进行细菌的初步分类和鉴定。
革兰氏染色的原理是基于细菌细胞壁的差异。
革兰氏阳性菌具有较厚的细菌细胞壁，由于其壁中含有较多的肽聚糖和穿过壁的肽聚糖横向支链，革兰阳性菌在染色过程中能够较好地固定紫色染料，显示为紫色。
而革兰氏阴性菌则具有较薄的细菌细胞壁，壁中的肽聚糖和肽聚糖支链较少，使得革兰阴性菌无法固定紫色染料，而显示为红色。
革兰氏染色法的原理还与染色液中紫色染料的结构有关。
紫色染料中的亚甲基紫分子带有正电荷，而革兰阳性菌细胞壁中的较多的负电荷物质使其对亚甲基紫具有亲和力，从而固定了紫色染料。
而革兰阴性菌细胞壁中的负电荷物质相对较少，因此无法固定紫色染料，而被酒精洗去，再经过后续的红色染料染色，显示为红色。
然而，革兰氏染色法也存在一些局限性，比如一些细菌可能失去一些特性，导致染色结果不准确。
此外，一些细菌在真菌的单位时间染色效果不佳，也需要进行其他进一步的鉴定方法。
因此，在细菌分类和鉴定中，革兰氏染色法常常与其他染色方法和生化试验相结合使用，以提高鉴定的准确性和可靠性。
细菌革兰氏染色实验报告
细菌革兰氏染色实验报告实验细菌的革兰氏染色实验八、细菌革兰氏染色实验一、实验目的和内容目的:1.熟悉油镜的使用与保养。
2.掌握细菌革兰氏染色法的原理及实验操作。
3.了解革兰氏染色实验在细菌分类鉴定上的重要性。
内容:1.学习显微镜(油镜)的使用和保养。
2.学习细菌革兰氏染色实验。
3.用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片并判断其结果。
二、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C(Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
染色前必须先固定细菌，其目的有二:一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上;二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
三、实验材料和用具(1)菌种:培养12-16h的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)或者枯草杆菌(Bacillus subtilis)，培养24小时的青枯假单胞杆菌。
(2)染色液和试剂:吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液、结晶紫、鲁哥尔碘液、95 %酒精、复染剂(蕃红)、二甲苯、香柏油。
(3)器材:废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、打火机、记号笔、擦镜纸、显微镜。
四、实验步骤:?涂片:取干净载玻片一块，在载玻片的加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，做成菌液。
干燥(可过火3—4次)制成薄的涂面，注意取菌不要太多，过火速度要快。
? 初染:在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1 min，倾去染液，流水冲洗至无色。
? 媒染:先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1 min，后水洗。
? 脱色:除去残水后，滴加95 %酒精进行脱色约15,20 sec，后立即用流水冲洗。
? 复染:(来自: 写论文网:细菌革兰氏染色实验报告)滴加复染剂——番红染色液，染3,5 min，水洗后用吸水纸吸干。
微生物实验报告
微生物实验报告答案【篇一：微生物的革兰氏染色实验报告】=txt> 二、实验目的：1、学习并初步掌握革兰氏染色法；2、认识革兰氏染色的原理；3、稳固显微镜的使用。
三、实验原理：革兰氏染色是 1884 年丹麦病理学家 christain gram 氏创办的，是细菌学中最重要的鉴识染色法。
染色步骤分为四个部分：1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片；2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物；3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色；g- 和 g+ 细胞壁的比较：1、阳性（ g+ ）菌细胞壁特色：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖组成，肽聚糖含量高，构造密切，脂类含量低。
当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保存在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。
2、阴性（ g- ）菌细胞壁特色：细胞壁薄，由两层组成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状构造交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性加强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，所以，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（比如大肠杆菌）。
四、实验器械：1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
2、溶液和试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、 95% 乙醇、番红复染液、水。
3、仪器及其余用品：酒精灯、载玻片、显微镜、接种环、试管架、滤纸、滴管。
五、实验步骤：1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦抹洁净，直至液体不再其上缩短为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按惯例方法图片，应涂大，不宜过厚。
2、翻开酒精灯，用火焰固定，不宜烤得太狠，不然菌种呈假阳性。
3 、轻旋结晶紫染液滴管，将其旋出，滴加 1 滴草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位（轻晃使其完整覆盖），染色40s 。
4 、染色达成后倾去染液，水洗至流出水为无色。
5 、将玻片上残留水用滤纸吸去，待其干燥。
简速格兰阳性球和革兰阴性杆菌鉴定的流程
简速格兰阳性球和革兰阴性杆菌鉴定的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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革兰氏染色及镜检操作规范培训
革兰氏染色及镜检操作规范培训一、培训目的革兰氏染色及镜检是微生物学中常用的检测方法，用于鉴定细菌的形态、结构、分布和染色性质等特征，是临床微生物检验中重要的工作之一、本次培训旨在加强操作规范意识，提高操作技能，确保准确、可靠地进行革兰氏染色及镜检。
二、培训内容及步骤1.革兰氏染色操作规范（1）准备培养基和试验用具，并消毒。
（2）取一根无菌的一次性培养皿棒，取少量细菌涂抹于玻片上。
（3）让涂抹的细菌悬于玻片上风干。
（4）用火钳夹取镊，将玻片迅速通过火焰杀菌一次。
（5）将玻片放置在玛丽兰染色架上，添满紫水，静置1分钟。
（6）将玻片倾倒，冲洗干净。
（7）加碘定色，静置1分钟。
（8）将玻片倾倒，冲洗干净。
（9）滴加酒精洗脱剂，静置1分钟。
（10）将玻片倾倒，冲洗干净。
（11）用吸水纸吸干水分。
（12）将玻片放在显微镜玻璃片上，加一滴油，镜检。
（13）观察细菌形态、结构和染色性质，并进行记录。
2.革兰氏染色注意事项（1）玻片的制备过程要保持无菌操作，避免细菌交叉感染。
（2）玻片烘干后才能进行染色，否则会影响染色效果。
（3）每一步的时间控制要准确，过长或过短都会影响染色效果。
（4）注意使用染色剂的浓度和时间，过浓或过淡都会影响染色效果。
（5）冲洗时要充分冲洗，以保证染色结构的清晰度。
（6）显微镜的调整要适当，以获得清晰的镜检结果。
（7）操作过程中要注意安全，避免受伤或发生意外事故。
三、培训效果评估在培训结束后，进行实际操作，检测并评估参训人员的操作能力和操作规范性。
培训效果评估主要从以下几个方面进行评估：1.操作准确性：参训人员能否正确完成革兰氏染色的每一步操作。
2.操作规范性：参训人员是否按照操作规范进行染色操作，是否注意操作的细节。
3.观察记录准确性：参训人员是否能准确观察、记录细菌形态、结构和染色性质等结果。
4.安全意识：参训人员在操作过程中是否注意安全，是否进行事故防范措施。
四、培训总结革兰氏染色及镜检是临床微生物检验中常用的方法，掌握其操作规范意义重大。
革兰氏染色法操作规程
革兰氏染色法操作规程一、实验准备1.工作台、培养瓶、试管、移液器等必需设备材料的清洁和消毒。
2.需要的培养基、试剂和染色剂的准备。
3.微生物实验室内的操作区域消毒。
4.需要检测的细菌样本，应是新鲜培养的活菌。
二、实验步骤1.将培养的细菌接种物涂布于平板培养基上，培养时间一般为16小时到24小时，以获得足够数量的活菌。
2.取一到两个细菌菌落，用无菌吸铬钢线将菌落挑取，加入到新鲜制备的无菌蒸馏水中制备细菌悬浮液。
3.将细菌悬浮液分装到无菌试管中，并对其进行标记以便辨别。
4. 将试管放入无菌离心机进行离心处理，离心速度一般为3000rpm，离心时间约为5分钟。
5.取出离心后的试管，将离心液倾倒掉，保留细菌沉淀。
6.用无菌注射器吸取一定量的蒸馏水，在细菌沉淀中做三次洗涤，每次洗涤后进行离心处理。
7.吸尽洗涤液后，用吸水纸吸去残余水分，使细菌沉淀尽量干燥。
8.用火焰消毒的铅笔划定干净试验玻片两侧的带标记区域。
9.取少量细菌沉淀用铅笔将其在试验玻片上涂成条状。
10.将涂有菌液的玻片放置在火焰中加热烘干，将菌液固定在玻片上。
11.将固定好的玻片依次进行以下操作：(1)滴加革兰氏碘液，静置1分钟。
(2)用蒸馏水清洗草绿色的碘液，盖过玻片的边缘。
(3)滴加酒精洗涤剂(80%)，使玻片浸泡在酒精中，30秒内亮紫色的溢出。
(4)用蒸馏水冲洗玻片，直至玻片溢出无色为止。
(5)滴加索式葡萄染料，使玻片完全覆盖，静置30秒。
(6)用蒸馏水冲洗玻片，直至落出少量菌落。
12.用吸水纸将玻片表面水分吸干，然后放置在通风处晾干。
13.晾干后的玻片放到显微镜下，用油镜检测。
14.观察和记录细菌的形态特征，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的结构差异。
三、实验注意事项1.所有的试剂和设备都要经过严格消毒处理，防止外部污染。
2.操作过程中要注意无菌操作，避免细菌受到污染。
3.离心过程中要注意离心机的平衡，以免产生震动。
4.细菌沉淀尽量干燥，以便于后续染色步骤。
革兰氏染色试验
革兰氏染色实验革兰氏染色(Gram Staining)是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同,可将细菌分成两类,即革兰氏阳性(Gram Positive)与革兰氏阴性(Gram Negative).(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯•克里斯蒂安•革兰于1884年所创造).未经染色之细菌,由于其与周围环境折光率差异甚小,故在显微镜下极难观察.染色后细菌与环境形成鲜明比照,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,而用以分类鉴定.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌:革兰氏阳性菌：葡萄球菌属(主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等)、链球菌属(肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等)、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽抱杆菌等,其中,金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸檬酸菌属、假单胞菌属〔绿脓杆菌等〕、莫拉菌属〔卡他莫拉菌等〕、奈瑟菌属〔淋球菌、脑膜炎双球菌等〕、不动杆菌属〔鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等〕、克雷伯菌属〔主要是肺炎克雷伯杆菌〕、沙门氏菌属、志贺氏菌属〔痢疾杆菌等〕、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属〔杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等〕、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等.革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%,且大多菌株容易对抗菌药物耐药,产生“新德里金属酶" 〔NDM-1〕的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌〔主要是大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌〕.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌.大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌,它们能产生外毒素使人致病,而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌,它们产生内毒素, 靠内毒素使人致病.细胞形态和结构细胞的根本结构包括细胞壁和原生质体两局部.原生质体位于细胞壁内,包括细胞膜〔细胞质膜〕、细胞质、核质和内含物.另外细胞还含有有些特殊结构,主要有荚膜、芽抱、鞭毛和菌毛等4种.1 .细胞壁革兰氏染色的机理主要是抓住了革兰氏阳性细菌与阴性细菌在细胞壁的结构与组成上的不同,具体比拟见下表：进一步的,革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖构成,细胞外表整体带负电的局部原因就是由于磷壁酸带负电.同时,磷壁酸赋予了革兰氏阳性细菌以特异的外表抗原.总的说来,细胞壁结构的差异导致了染料吸收的差异,也导致了很多生理特性的不同.2 .非细胞壁结构性性一兰早明性郛菌•兰氏阴性细菌外壁层结构Hl# nm)Z-J0三房飞三、M配/F冬吟日T5%汪单位交联,正箔益密上图华巳翔阳碑位空於瞬曲城沱=1阴m性美系腾箍二汩性1毛『|』口%福如5%; “ D%土蜜〔龄一蛔王五宅法天五蛋E五一或无无fi指雪龙三存11S-22%在非细胞壁结构中,革兰氏阳性细菌和阴性细菌主要的区别在于是否有芽抱和鞭毛与性菌毛的不同上.芽孢是某些细菌菌体发育过程中的一个阶段,在一定的环境条件下由于细胞质和核质的浓缩凝集形成的一种特殊结构.革兰氏阴性细菌中没有会形成芽抱的菌种,而局部革兰氏阳性细菌可以.另外,在鞭毛和性菌毛方面两者也有不同.鞭毛和性菌毛都是附属物.某些细菌外表伸出的细长、波曲的附属物称为鞭毛.革兰氏阳性细菌的鞭毛上根本着生两个环,革兰氏阴性细菌那么根本着生四个环.性菌毛只见于革兰氏阴性菌,参与细胞间称作接合作用的交配过程.生理特性以下是关于革兰氏阳性细菌和阴性细菌在生理特性方面的比拟. 两者的不同从本质上来说,还是主要是由细胞结构的不同所决定的.用日虽兰对日性细菌革兰氏阴性和菌对机械力的抗性强弱至1胞壁抗花菌南弱〔砂感〕理〔不原感,*对青毒春、磷胺钻感不勘感*对链霉素、氯霉素、哩F素八城魅前感对碱性霜的抑菌作用强弱*对阴离子去污剂敏感不敏感*对叠氨叱论颍感不勖感对一曜血性强疝件弱代卅抱壁最外层中脂务雄阻碍流阕诙、亩牛叁.染料、去污各I等式十分千番入步骤：革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是：〔1〕制片.取菌种培养物常规涂片、枯燥、固定.要用活泼生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热〔以玻片不烫手为宜〕.〔2〕初染.滴加结晶紫〔以刚好将菌膜覆盖为宜〕染色1-2min,水洗.〔3〕媒染.用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1min,水洗.〔4〕脱色.用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色缺乏,阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌.因而脱色时间一般为 20-30S.〔5〕复染.用番红液复染约2min,水洗.〔6〕镜检.枯燥后,用油镜观察.菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌, 被染成红色的为革兰氏阴性菌.明第名燃料S扇港U疑isr：i生五丸红匕用说也染#1；i月等红化江电韭闲箱状.亚色t用酒新瑞色原理:通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,再用95%乙醇脱色.革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇或丙酮脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色 [1].染色的差异主要是阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的.①革兰氏阳性细菌的细胞壁G+细菌细胞壁具有较厚〔20-80nm〕而致密的肽聚糖层,多达50层,占细胞壁成分的40%〜95%,它同细胞膜的外层紧密相连〔图2-9〕.有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸〔teichoic-acid〕,也称胞壁质〔murein〕,它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在.由于磷壁酸带负电荷,它在细胞外表能调节阳离子浓度.磷壁酸与细胞生长有关,细胞生长中有自溶素〔autolysins〕酶类起作用,磷壁酸对自溶素有调节功能,阻止胞壁过度降解和壁溶.如果细胞壁的肽聚糖层被消溶,G+细胞成为原生质体(protoplasts),细胞壁不复存在,而只存留细胞膜.除链球菌外, 大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质.②革兰氏阴性细菌的细胞壁G一细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄(15〜20nm)而结构较复杂, 分外膜(outer membrane)和肽聚糖层(2〜3nm)(图2-10).在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间,称为壁膜间隙(periplasmic space).外膜G—细菌细胞壁外膜的根本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同细胞质膜相同之处也是双层类脂,但除磷脂外还含有多糖和蛋白质.LPS的多糖局部包括核心多糖和O-特异多糖.O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖) 和二脱氧已糖.由于糖的种类不同,使各种G—细胞具有不同特性的LPS.核心多糖(core polysaccharide)的主要组分是酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO).外膜中还含有几种蛋白,如脂蛋白、通透蛋白.有些蛋白具有通孔作用(porin),调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的,它的毒性组分常称为内毒素(endotoxins).肽聚糖层G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄,在大肠杆菌和其它细菌中仅有单层.肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来.壁膜间隙G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙,一层薄的肽聚糖处于其间,肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽,肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄.大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12〜15nm,呈胶胨态.其间含有三类蛋白质：水解酶,催化食物的初步降解；结合蛋白,启动物质转运过程；化学受体(chemoreceptors), 在趋化性中起作用的蛋白.染色结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色.。
革兰氏染色试验步骤
革兰氏染色试验步骤所需试剂和设备：1.菲尔水2.结晶紫3. Lugol液4.酒精5.活菌片6.显微镜7.显微制片玻片8.火焰消毒器实验步骤：1.取一枚无菌的显微制片玻片，并用菲尔水清洗干净，以保证玻片无污染。
2.取一滴无菌的水滴在玻片上，将一枚均匀悬浮的细菌样品加入水滴中。
细菌样品可以是培养物中的细菌液体培养物，也可以是细菌单克隆的菌落。
3.用火焰消毒器将显微镜取出并消毒。
将显微镜调整为100倍放大倍数，并将显微镜使用菲尔水沾湿。
4.用火焰消毒器将显微镜片摆放在火焰上加热，待其冷却后再用纸巾擦拭干净。
确保显微镜片无污染。
5.用取有活菌片的设备，在细菌悬液上取片，使细菌均匀分布于显微片的表面上。
待片上的细菌液体干燥后，将片置于火焰中加热数秒，以固定细菌在片上。
6.将固定后的细菌片依次按如下顺序进行染色:用菲尔水冲洗干净玻片上的细菌，倒入1-2滴的结晶紫液，静置1分钟。
7.用菲尔水冲洗细菌片，直到从玻片上冲洗下结晶紫。
8. 倒入1-2滴的Lugol液，静置1分钟。
9. 用菲尔水冲洗细菌片，直到从玻片上冲洗下Lugol液。
10.迅速地将细菌片倒入酒精中，进行脱色。
脱色的时间应控制在10-20秒之间，直到从细菌片上冲洗下少量酒精。
11.用菲尔水冲洗细菌片，直到从玻片上冲洗下酒精。
12.将细菌片放在火焰上加热数秒，使其干燥。
13.将细菌片挂在显微镜上，通过100倍的放大倍数观察细菌的形态和染色性质。
在革兰氏染色中，革兰氏阳性细菌呈紫色或紫黑色，而革兰氏阴性细菌呈红色或粉红色。
观察细菌形态和染色性质可以帮助确定细菌的分类。
革兰氏染色
，药敏实验。
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染色液配制：
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结束语
若有不当之处，请指正，谢谢！
➢ G+菌细胞壁中肽聚糖肥厚且交联度高， 类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽 聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细 菌仍保留初染时的颜色。
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➢ G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂 类，而且肽聚糖较薄，交联度低，故用乙醇脱 色时溶解了类脂类，增加了细胞壁的通透性， 使初染的结晶紫-碘的复合物易于渗出，细菌被 脱色，再经过沙黄复染后成为红色。
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三 .实验仪器及材料
➢ 1 仪器：显微镜、酒精灯等 ➢ 2 实验材料：
菌种：大肠杆菌，葡萄球菌 染色剂：草酸铵结晶紫、沙黄 媒染物：碘液 脱色剂：95%的酒精
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四.内容与方法
➢ 1 .涂片 ，2. 晾片， 3 .固定 ，4 .结晶紫染色： 加适量的结晶紫染色2min，5 .水洗：倾去染色 液，用水缓慢冲洗衣 ，6 .媒染：碘液，媒染 2min，7 .水洗，用水冲去碘液，8 .脱色：将玻 片倾斜，连续滴加班95%乙醇脱色30s，9 .复染： 滴加沙黄复染1min。10 .水洗，11. 晾干：将染 好的涂片用水吸干。12 .镜检时先用低倍，再用 高倍，最后用油镜观察，判断菌体的革兰氏染 色反应性。
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革兰氏染色步骤:
涂片
大肠杆菌
固定
葡 草酸铵结晶紫
革兰氏碘液
95%乙醇
沙黄
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2 、增加显微镜的分辨率
D值愈小则表明分辨力愈强。
D=0.61λ/NA
分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离的能力。
NA=n· sinα/2
λ：光波波长 NA：物镜的数值孔径值
n：介质折射率
α：镜口角（总是小于180°）
三、实验器材
1 、标本：细菌三型玻片。
2 、试剂：香柏油、镜头清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）。
3 、器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸、玻璃棒等。
四、实验步骤
1 、放置标本:将染色的细菌三型玻片置于镜台上。 2 、找合适的视野: 先用低倍镜寻找合适的视野并将欲观察的 部位其移到视野中央。 3 、转换油镜：将油镜转到工作位置。 4 、调节聚光器与油镜数值孔径一致 ： 将聚光器上升到最高 位置，可变光阑开到最大。 5 、加香柏油：使油镜镜头浸入香柏油中。注意油镜镜头千万 不要压在玻片标本上。 6 、调焦： 转动粗调焦螺旋，再缓慢地提升油镜调焦至物像 清晰。注意下降或上升镜筒或载物台绝不可用力过猛。 7 、观察: 仔细观察细菌的三种基本形态 8 、显微镜用毕后的处理: 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜
四、实验步骤
1 、革兰氏染色
涂片： 用接种环挑取少许菌苔于水滴中混匀后，再挑取2-3 环菌悬液至另一载片上涂开。
干燥： 室温自然干燥或电吹风吹干 固定： 涂片朝上，通过火焰2-3次，
初染：滴加草酸铵结晶紫覆盖涂片区域染色2min，水洗。
染 色
媒染：滴加卢氏碘液，染色1min，水洗。 脱色：用滴管加95%乙醇冲洗脱色约30秒，立即水洗。 复染：滴加番红液复染约2min，水洗。
实验一 显微镜（油镜）的使用和细菌 的三种基本形态观察
一、实验目的 1、学习并掌握油镜的基本原理和使用方法。 2、观察和识别细菌的三种基本形态。
Hale Waihona Puke 二、基本原理1 、增加照明强度
在油镜与载玻片之间加入与玻片的折射率相仿的 镜油，使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失， 基本上全进入镜头，结果提高了照明强度，使图像更 加清晰。 折射率(n) 空气 1.00 水 1.33 香柏油 1.52 玻璃 1.55
镜检
清洁显微镜
2、芽孢染色
制片 染色 滴加孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片在 微火上 加热至染液冒蒸汽时开始计时5min。 加热过程中要及时添加染色液，切勿让标本干涸。 水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出的水无 色为止。 复染 用番红染色液复染2min 水洗 待玻片冷却后，用缓流自 来水冲洗至流出的水无 色 为止。 镜检 干燥后用油镜观察
棒状杆菌
螺旋菌
注意事项
1 、油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切
忌用眼 睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从 侧面注视。 2 、调焦时，应特别注意，切勿将粗调节器向反 方向(由高向低)转动而损失镜头和玻片。
实验报告
1、绘细菌三种基本形态图
2、简述油镜的工作原理
实验二 细菌的芽孢染色和 革兰氏染色法
染色结果（革兰氏染色）
枯草芽孢杆菌（革兰氏染色）
大肠杆菌（革兰氏染色）
染色结果（革兰氏染色）
金黄色葡萄球菌（革兰氏染色）
染色结果（芽孢染色）
枯草芽孢杆菌（芽孢染色）
注意事项
1、革兰氏染色关键是脱色时间，如脱色时间过长，会 造成假阴性。如脱色时间过短，会造成假阳性。 2、革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h菌龄的细菌为 宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性 菌转呈阴性反应。 3、芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在 菌体内为宜。芽孢杆菌一般在37℃下培养12-14h效果 最佳。 4、在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂 片干涸。
一、实验目的
1 、学习并掌握革兰氏染色和芽孢染色的 原理和方法。 2 、了解革兰氏染色和芽孢染色在细菌分 类鉴定中的重要性。
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理 革兰氏染色法是Gram发明的一种细菌鉴别染色法， 通过这种染色方法，可将细菌分为两大类： 一类被染成紫色，称为革兰氏阳性细菌； 一类被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。 其染色原理主要根据两类细菌的细胞壁化学组成和 结构不同。
三、实验器材
1 、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。 2 、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、 95%乙醇、番红复染液； 芽孢染液:5%孔雀绿染色液、 0.5%番红水溶 液。 3 、器具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、 木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸等。
实验报告
1、绘枯草芽孢杆菌图
2、将革氏染色结果填于下表
菌种 大肠埃希氏菌 菌体颜色 菌体形态（图示） G+或G-
染色结果：阳性细菌（G+）： 染成紫色 染色结果：阴性细菌（G-）： 染成红色
2 、芽孢染色原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着 色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。 芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后 又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿 或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料 不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水 洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当 用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染 剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理
通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可 形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物，G+细菌由于 其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，因此遇脱 色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含 类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与 碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。 反之， G-细菌的细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖 层薄，交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜 迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与 碘复合物的溶出，因此细胞褪成无色。再经番红、沙黄 等红色染料复染, 就使G-细菌呈现红色, 而G+细菌则保 留紫色。