拟南芥基因组DNA的提取

拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。

二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。

植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。

2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。

突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。

拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。

由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。

3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。

除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。

4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。

关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。

T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。

，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。

同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。

借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。

以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。

由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。

由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档

基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定点突变、插入、缺失、置换等，再研究这些修饰对生物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和其编码蛋白质在生物体内的功能。
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养；基因组小，只有5对染色体。拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系；每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定资料讲解

▪ 第一管：
▪
10xTaq buffer
min，再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心10 min，
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
▪
81.8 g NaCl
▪
0.2%(V/V)β-巯基乙醇
▪注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
▪酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1
▪氯仿/异戊醇： 24：1
▪TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L
▪3 M NaAc（pH 5.2）
左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP：
TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带：1107bp 用LB+RP产生小带：560-860bp
三、实验步骤
▪ 实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分离群体30个株号的植株。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
▪ 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
▪ PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体， LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。

实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。

通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。

关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统1.前言拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。

同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。

2.实验2.1实验目的（1）提取植物基因组DNA的方法；（2）PCR操作方法；（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。

2.2实验原理Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。

将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。

拟南芥的遗传工程

拟南芥的遗传工程拟南芥是一种小型的花卉植物，也是遗传学研究中最为常用的模式生物之一。

开展拟南芥的遗传工程可以为其生长方式、形态特征、反应机制等方面的研究提供有力的支持，有助于进一步深化人类对生命运作机理的认识。

拟南芥的基本遗传信息拟南芥是对称性叶状植物茎节数量达到300，花的蕾囊非常小，可在显微镜下观察。

其基因组大小约为125兆字节，核基因组具有5条染色体，端粒长度不到3kb，叶绿体长度为154kb，其每个细胞都有大约12个叶绿体。

拟南芥拥有约27,000个基因，占整个基因组大小的20％。

拟南芥的遗传转化技术目前，拟南芥的遗传转化技术主要包括农杆菌介导的遗传转化和生物素-结构的介导遗传转化。

农杆菌介导遗传转化技术是一种利用农杆菌侵染细胞后将遗传物质转移至目标生物细胞的技术。

该技术可通过简单、稳定和快速的途径将确定的DNA序列插入到植物细胞的基因组中，从而实现外来源基因的改变。

尽管农杆菌介导遗传转化技术在多数作物上都有广泛应用，但该技术在转移DNA之后，难以控制新的基因组改变和位置影响，这可能影响实验结果的可重复性。

与此不同，生物素-结构的介导遗传转化技术可在不需要遗传材料经过的过程中向植物细胞输送纯的DNA检测表头结果。

介导者生物素(med‐strombin) 在植物细胞中易与融合度高的DNA结合，制造出具有生物素的DNA结合来，从而实现把选定的DNA序列插入到目标生物细胞的有选择性的插入和表达。

拟南芥遗传转化技术的应用拟南芥可以被用来研究染色体的分离和纯化以及基因的表达、诱变和注释等方面。

这些特性被广泛应用于遗传学和分子生物学实验中，以支持人类对生命机理的认识。

例如，在研究肿瘤的起源和发展过程中，拟南芥可以被用来研究基因表达的变异以及肿瘤细胞与正常细胞之间基因表达模式的异同。

此外，拟南芥还可以被用于探究人类疾病的发病机制，帮助科学家更好地理解和治疗多种疾病。

结论拟南芥的遗传工程为遗传学和分子生物学的发展提供了强有力的支持。

实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE 2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、Taq DNA聚合酶 3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
一提取植物DNA；
二.PCR反应；
三.琼脂糖凝胶电泳；
一.提取植物DNA的步骤
(略)
二.PCR鉴定
1.制作反应体系（先混合在分装最后单独加模板）
试剂 ddH2O 10×Tap buffer(Mg2+ free) 模板DNA（3050ng/ul）引物LP（10um）引物RP（10um）引物BP（10um） dNTP(各2.5mM) Tap酶（5U/ ul）反应体系总体积单管I（μl） 16 2.5 2 1 1 NO 2 0.5 25 20 5 混合I 160 25 10 10 单管II（μl） 16 2.5 2 NO 1 1 2 0.5 25 10 10 20 5 混合II 160 25 -
杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA 中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。 T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用
农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。
实验材料
野生型（Col）、ibm1突变体（SALK_023533）拟南芥植株 IBM1(AT3G07610)是拟南芥中组蛋白修饰酶的编码基因，能影响植物的诸多的发育和生殖过程。

TAKARA植物DNA提取试剂盒说明书

加入 Extraction Solution 1 振荡仪振荡 5 秒，轻微离心
加入 Extraction Solution 2 振荡仪振荡 5 秒，轻微离心
加入 Extraction Solution 3 振荡仪振荡 5 秒，轻微离心
50℃温浴 15 分钟
上层水相移至新的 Microtube 中加入异丙醇混匀后，12,000 rpm 4℃离心 10 分钟
-1-
8. 轻微离心 2 秒钟以内，于 50℃温浴 15 分钟。注：长时间离心 Extraction Solution 3 将会分层，务必控制在 2 秒钟以内。
9. 12,000 rpm 4℃离心 15 分钟。 10. 取上层水相移至新的 1.5 ml Microtube 中，上层水
相约 400 μl。注意尽量不要混入水相以外的物质。 11. 添加等量的异丙醇，轻柔混匀。
除去上清，加入 1 ml 70％乙醇清洗沉淀 12,000 rpm 4℃离心 3 分钟
●实验例
除去上清，沉淀干燥后用 TE Buffer 溶解
实验例 1：从植物组织中提取基因组 DNA
将拟南芥的幼芽、西红柿的幼芽和菠菜叶用剪刀剪至 3 mm 以下角形状，分别称取 20 mg 和 50 mg 放入
1.5 ml Microtube 中，于-20℃冻结后按“操作方法”进行基因组 DNA 的提取，基因组 DNA 使用 20 μl TE
淀。注：沉淀过度干燥将导致难以溶解，请注意。
注 1. 回收的基因组 DNA 溶液可直接作为 PCR 反应的模板或直接进行限制酶切断等反应。使用 20 μl TE Buffer 溶解基因组 DNA 时，PCR 反应液（25 μl 反应体系）或限制酶酶切反应液（20 μl 反应体系）中添加的 DNA 溶液在 0.5～2 μl 之间为好。

植物基因组DNA的提取和定性、定量分析范文

《分子生物学》实验报告实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。

【实验原理】CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。

利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。

然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。

把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。

DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA 分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。

凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。

核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL，ssDNA 33 μg/mL和ssR NA 40 μg/mL。

可以此来计算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选

内蒙古农业大学硕士学位论文MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选姓名：王晓娟申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：于卓;杨丽梅20070501１８ＭＴｌ２和Ｂｔ转基因拟南芥的鉴定及筛选试验设定了７个卡那霉素浓度梯度，分别为：５０、１００、２００、３００、４００、５００１１１９／Ｌ。

由表ｌ可见，卡那霉素对试验材料的发芽率没有显著影响，而对幼苗白化率有显著影响，随着浓度的增大，幼苗白化率逐渐增高。

说明卡那霉素不影响种子萌发却能抑制芽的生长。

当浓度达到３００ｍｇ／Ｌ时，未转化基因的野生型拟楠芥种子３个处理全部白化，无一株成活的绿茁，而转基因Ｔｌ代种子仍有部分幼苗正常生长。

本试验采用的卡那霉素筛选浓度定为３００ｍｇ／Ｌ。

图２卡那霉素浓度从左至右分别为５０、２００，３００ｍｇ／Ｌ时对照Ｃｏｌｏｍｂｉａ筛选２０ｄ的表现Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｎｏｎ·ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ表５ａ００ｍｇ／Ｌ卡那霉素对ＴＩ代种子筛选结果Ｔａｂｌｅ５ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＴ５ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｅｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ３００ｍｇ／Ｌ图３卡那霉素浓度３００ｍ∥Ｌ时Ｔｓ代转基因种子和未转化亲本筛选２０ｄ时的对比Ｆｉｇ３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＬｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｏｅｄｓａｎｄｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｓ∞ｌｅ，ｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ内蒙古农业大学硕士学位论文１９将试验中得到的Ｔｌ代８７株抗性苗编号移栽到苗钵中，在人工气候培养室培养。

待到收获时严格单株收获种子，即Ｔ２代种子。

继续用３００ｍｇ／Ｌ的卡那霉素进行筛选，直到抗性不再发生分离时，结束试验。

试验中，在Ｔ３代就已经有全部呈现抗性的材料出现，后又对其进行了两代筛选，确保抗性基因达到了纯合。

CTAB提取拟南芥基因组DNA

用 70%预冷乙醇 1ml 冲洗沉淀两次，上下颠倒几次，不能 Vertex， 12,000g 离心 3min，弃上清乙醇充分挥发后（通风橱吹干，为无色透明），用 30ul ddH2O 溶解。保存于冰上电泳
若没分离好 12,000rpm，离心 10min
取上清约 600ul，加入与上清等体积的氯仿，可 Vertex. 12,000rpm 离心 10min 离好（即上下分层）后取上清约 350ul，加入 100%乙醇约 700ul 混匀，上下颠倒几次，不要 Vertex。在-80℃放置 30min 4℃ 12,000g 离心 20min，弃上清
生物科学专业分子生物学实验流程
实验一
植物基因组 DNA 的提取步骤
称取约 100mg 拟南芥嫩叶，在液氮中研buffer 混匀，颠倒几次，可 Vertex.
65℃温浴 30min，其间每 10min 有规律的颠倒 tube
平衡至室温（开 tube 盖前甩一下），加入 0.6ml 苯酚/氯仿（1︰ 1）混匀，充分悬浮，可 Vertex.

简单粗暴提取拟南芥DNA-1

Simple, but robust and highly scalable protocol简单粗暴法提取DNA1. 四片以上叶子的苗龄时，取一片适当大小（0.5-1cm2均可，没必要太大）；2. 加钢珠和500μL extraction buffer，磨样3min，12000rpm离心10min（时间不可太短，否则无法充分分层）；3.吸取400 ~450μL上清（尽量不要吸到叶片组织沉淀）至1.5mL离心管，加等体积异丙醇（或2倍体积冰乙醇）沉淀，-20℃放置30min左右，离心5min；4.倒掉乙醇，加500μL 75%乙醇，泡洗10min后倒掉75%乙醇，可重复洗1遍；5.晾干（最好过夜），加100μL ddH2O溶解，约1hr后即可取1μL左右直接做PCR（10μL的PCR体系）模板。

说明：1.extraction buffer配方（1L）：12.1 g Tris, 28.1 g NaCl, and 18.6 g EDTA（实是乙二胺四乙酸二钠即EDTA Na2，加水溶解并定容至1L；分子生物学实验一般都是用的EDTA Na2，所以一般默认简称EDTA）2.本方法改编自：Alonso J M, Stepanova A N. Plant Functional Genomics:Methods and Protocols[M].2nd ed. Humana Press, 2015. 326-335（大家可以看看这本书，方法挺全）3.此法提取DNA，室温放2个月做PCR没有问题，没有试过放更长时间（更长时间建议还是放-20℃冰箱）。

检测2Kb片段扩增成功（更长片段没有试过，可用于做TAIL PCR）。

因没有用氯仿、异戊醇抽提，全程可不用在通风橱操作。

所提DNA中蛋白含量稍高，加水后有白色不溶物属正常现象，不影响PCR。

t-DNA鉴定1

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• DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入 DNA经溴乙锭（EB）染色，经溴乙锭 DNA双螺旋结构两个碱基之间双螺旋结构两个碱基之间， DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（ nm可见光可见光）。产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。
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• 利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体 PCR
• LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物 LP和RP是植物基因组上 DNA插入位点两测的引物是植物基因组上T • BP是T-DNA区段上的引物 BP是 DNA区段上的引物
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PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：由变性--退火延伸三个基本反应步骤构成：由变性退火--延伸三个基本反应步骤构成
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步骤
• 1.用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离 1.用液氮将100 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 用液氮将心管中加入预热至65℃ 65℃的 CTAB提取液提取液，心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀。摇混匀。 • 2.65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。 2.65℃水浴水浴30 min，其间轻摇混匀。 • 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：），室温下向上清液加入等体积的氯仿轻轻混匀10 min， rpm离心离心15 min，轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。新管。 • 4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀， 4.向上清液中倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，向上清液中2 rpm离心离心15 min，弃上清。 -20 ℃ 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。 • 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次乙醇洗涤沉淀一次， rpm稍离心弃上清。稍离心， • 6.将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 6.将沉淀晾干将沉淀晾干， 208.0)， 65℃水浴水浴30 min溶解DNA。溶解DNA min溶解DNA。 • 7. 琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量。

一种适用于大规模转基因作物PCR检测的简易DNA提取方法

一种适用于大规模转基因作物PCR检测的简易DNA提取方法钟罗宝，陈谷（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）摘要：近年来，转基因农作物的数量和种类大幅度增加，其安全性一直受到各国政府的重视和关注，转基因食品的检测也是各国贸易壁垒的一个重要方面。

PCR技术作为一种快速、准确的核酸检验方法，广泛地应用于转基因农作物和食品的检测中。

DNA样品的制备速度和质量是PCR检测方法的限速步骤之一，本文改进了碱裂法提取植物DNA，并与SDS快速提取法及CTAB法作比较，用于不同长度片段的PCR扩增。

结果显示：利用改进后的碱裂解法提取的DNA为模板可以稳定扩增出1000 bp以内的片段，这是一种简易的适合于大规模转基因作物和食品PCR检测的DNA提取方法。

关键词：转基因农作物；PCR检测；DNA提取；碱裂解法；拟南芥中图分类号：Q75；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)08-0794-05Study of a Simplified DNA Extraction Method for the Large-scale PCRDetection of Genetically Modified CropsZHONG Luo-bao, CHEN Gu（College of Light industry and Food science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China）Abstract: Recently, with the increase of quantity and species of transgenic crops, more and more attention has been paid on their safety. As a rapid and accurate method to detect the nucleic acids, PCR is widely used in the detection of genetically modified (GM) crops and food and one of its rate-limiting steps is the speed and quality of DNA extraction. Here the alkaline lysis method is modified and compared with SDS and CTAB methods in PCR amplification of fragments with different lengths. The results show that fragments less than 1000 bp can be steadily amplified from the DNA extracted by the modified alkaline lysis method. It is confirmed that the modified alkaline lysis method is suitable to be applied in the large-scale and rapid PCR detection of genetically modified crops as well as GM food.Key words: genetically modified crops; PCR detection; DNA extraction; alkaline lysis method; Arabidopsis thaliana随着转基因技术的成熟和推广，全球转基因生物及其产品迅猛发展，1996-2003年，全球转基因作物种植面积增加40倍，2004年全世界转基因作物种植面积为8100 万公顷，比2003年增长20%[1,2]。

拟南芥模拟植物实验报告(3篇)

第1篇一、实验背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种重要的模式植物，在植物遗传学、分子生物学和发育生物学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用。

由于其生长周期短、繁殖速度快、基因组相对较小、易于转化和遗传操作等特点，拟南芥成为科学家们研究植物生命现象的理想材料。

本实验旨在通过模拟拟南芥的生长过程，了解其生物学特性，并掌握相关实验技术。

二、实验目的1. 了解拟南芥的生长周期和生物学特性。

2. 掌握拟南芥种子萌发、移栽、生长和观察的基本实验技术。

3. 熟悉拟南芥的遗传转化和基因编辑方法。

三、实验材料1. 拟南芥种子2. 培养基（MS培养基）3. 培养皿、移栽盘、水培箱等容器4. 电转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等仪器5. 相关试剂（如DNA提取试剂盒、PCR试剂等）四、实验方法1. 种子萌发（1）将拟南芥种子用70%乙醇消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。

（2）将消毒后的种子接种到MS培养基上，置于培养箱中，保持适宜的温度和光照条件。

（3）观察种子萌发情况，记录萌发时间和生长状况。

2. 移栽（1）待拟南芥幼苗长到2-3片真叶时，将其移栽到移栽盘中。

（2）在移栽盘中加入适量的营养土，保持土壤湿润。

（3）观察移栽后的生长状况，记录生长时间和生长情况。

3. 生长和观察（1）将移栽后的拟南芥放置于水培箱中，定期更换营养液。

（2）观察拟南芥的生长状况，包括叶片、茎、根的生长速度和形态变化。

（3）记录生长数据，分析生长规律。

4. 遗传转化和基因编辑（1）利用电转化法将目的基因导入拟南芥细胞。

（2）通过PCR和DNA测序验证基因转化成功。

（3）利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥基因进行编辑，观察基因编辑效果。

五、实验结果与分析1. 种子萌发实验结果显示，拟南芥种子在消毒后2-3天内开始萌发，5-7天内大部分种子萌发，生长状况良好。

2. 移栽移栽后的拟南芥生长迅速，叶片展开，茎、根生长良好。

3. 生长和观察实验过程中，观察到拟南芥在适宜的生长条件下，生长速度较快，叶片、茎、根的生长状况良好。