第六章 微生物的生长繁殖及其控制
第六章 微生物的生长及其控制
生长曲线
对数生长期能保持多长？
从一个细胞开始； 大肠杆菌每20分钟繁殖一代； 如对数期为48小时； 可得到多少细胞？2144=2.23x1043 重量可达多少? 2.23x1043x10-12g/cell
=2.23x1031g=2.23x1025ton 重量为地球的4000倍.
(二)恒浊连续培养
通过连续培养装 置中的光电系统控制 培养液中菌体浓度恒 定、使细菌生长连续 进行的一种培养方式。
用于菌体以及与 菌体生长平行的代谢 产物生产的发酵工业。
(三)连续发酵与单批发酵相比
优点：缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；
环境条件控制技术
培养基成份控制
光照和黑暗交替培养
硝
酸
纤
离
维
心
素
法
滤
膜
法
连续培养（continous culture)
连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物 的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长 速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。
生长曲线
（3）稳定生长期（stationary phase）
稳定期的特点是： 生长速率常数等于零，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，
或正生长与负生长相等的动态平衡之中，这时菌体产量达到最高点。
在稳定期细胞开始形成贮藏物、形成芽孢、合成次生代谢产物。
稳定期到来的原因： 营养物耗尽； 营养物比例失调； 有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等条件的改变。
缺点：杂菌污染 菌种退化 营养物利用率较单批发酵低
第六章微生物的生长及其控制刘
1ml
9ml 9ml 9ml
9ml
1ml
1ml
1ml
×2 ×2
×2
2020/7/23
最常用的活菌计数法。
将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保 温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可 以计算出原菌液的含菌量。
直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为 宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数 原则，以平板菌落数在30~300之间为报告依据。
微生物学
直接法—— 涂片染色法
应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。
方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.01ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代 入公式： 每ml原菌液含菌数
=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100 ×稀 释倍数
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微生物学
直接法 —— 比浊法
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平板划线分离法
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
微生物学
2020/7/23
液体稀释法
微生物学
首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果, 使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管 中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就 是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.
步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新 鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以 得到20刚20/7刚/23分裂下来的新生细胞，即为同步培养。
微生物的生长繁殖及其控制
6.1.3微生物生长的测定方法
微 生 物 生 长 的 测 定
06第六章 微生物的生长及控制
1. 微生物生长繁殖的pH值
大多数细菌、放线菌喜欢生活在中性偏碱的环境中， 细菌最适的pH在7.0~8.0之间，放线菌的最适pH在7.5~8.5 之间； 而酵母菌和霉菌刚好相反，适合在偏酸的条件下生 长，霉菌的最适pH值在4.0~5.8之间，酵母菌在3.8~6.0之 间。
2. pH值对微生物生长的影响
稀释倒平板法
操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！
2. 膜过滤培养法
菌数低的样品（如水）→ 膜过滤 → 培养 → 菌落计数
3. 显微镜直接计数法
缺点：
① 不能区分死菌与活菌 ② 不适于对运动细菌的计数 ③ 需要相对高的细菌浓度 ④ 个体小的细菌在显微镜下难以观察
4. 比浊法
5. 重量法
为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？
氧气进入菌体后，能接受电子而产生不同还原性的氧 离子，如过氧离子、过氧化物自由基。过氧化物自由基和过 氧离子都是很强的氧化剂，对微生物有毒，能氧化微生物过 程中所必需的酶。 好氧菌、兼性需氧菌以及微量需氧菌体内含有过氧化 物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶。这两种酶能将过氧化物自由 基和过氧离子还原成没有毒性的水分子，所以它们不会被氧 气所杀死。耐氧菌虽没有过氧化氢酶，但有过氧化物酶，能 合成SOD，而不会被氧毒害。 厌氧菌体内都没有这些酶，所以不能忍受氧气。
将单位体积培养液中的菌体，用清水洗净， 然后放入干燥器内加热或减压干燥，最后测定其 干重。一般来说，干重约为湿重的10~20%，即 1mg干菌 = 5~10mg湿菌 = 4~5×109个菌体。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6.氮量法(生理指标法)
微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以 常作为生长量的指标。如细菌含氮量约为菌体 干重的14%。含氮量乘以6.25即可粗测出其蛋白 质含量。
第6章微生物的生长繁殖及其控制
将少量纯种单细胞纯微生物接种到恒体积液体培养 基中，在适宜的条件下，其群体会有规律生长，表 现出一个典型生长曲线。
细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图
一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期
细菌典型生长曲线
2 、pH值对培养基中有机化合物的离子化有影响， 因而也间接的影响微生物。
3、pH 值还影响营养物质的溶解度。
四 其他
干燥、渗透压、紫外线、抗生素和化学药物等。
第四节 有害微生物的控制
一 基本概念
1、灭菌(Sterilization)
采用强烈的理化因子使物体内外部的一切微生物永远 丧失其生长繁殖能力（包括最耐热的芽孢）的措施。
一个微生物细胞 合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。
如果同化作用的速度超过了异化作用
个体的生长 原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加 如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。 群体内各个个体的进一步生长
群体的生长
微生物生长: 在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）
3）连续加压（超高温）灭菌（Continuous autoclaving）
湿热比干热灭菌更好：
① 更易于传递热量；
② 更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构。
1）（加）高压蒸汽灭菌法或常规高压灭菌 （Autoclaving）
此法为实验室及生产中常用的灭菌方法。 它适用于各种耐热物品的灭菌，如一般培养基、 生理盐水、各种缓冲液、玻璃器皿、金属用具、工 作服等。 常采用 1.05kg /cm 2的蒸汽压，121 ℃处理 15～ 30min或115℃处理30～35min（含糖时），即可达到 灭菌的目的。
第六章 微生物的生长繁殖及其控制
（4） 衰亡期（decline phase） ） 衰亡期（ ）
1. 特点： 特点： 细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数， 细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体 中的活菌数目急剧下降，出现“负生长” 中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形， 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽 孢开始释放。 孢开始释放。 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、 溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 衰亡期比其他各时期时间长， 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条 件有关。 件有关。 产生原因：生长条件的进一步恶化， 产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大 超过合成代谢， 超过合成代谢，继而导致菌体的死亡
细菌生长曲线： 细菌生长曲线：把一定的细菌细胞接种在恒定容积的液体 培养基中在适宜条件下培养，定时取样测定细胞数目， 培养基中在适宜条件下培养，定时取样测定细胞数目，以细菌 细胞数的对数为纵坐标，以生长时间作横坐标绘制而成的曲线。 细胞数的对数为纵坐标，以生长时间作横坐标绘制而成的曲线。 ☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、 死亡的整个动态变化过程。 死亡的整个动态变化过程。 ☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却 每种细菌都有各自的典型生长曲线， 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。
生长速度和最大 收获量受影响
时间
应用意义： 应用意义： 由于此时期的菌种比较健壮， 由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适 菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； 菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期， 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密 度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色、 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等 遗传研究或进行染色 的良好材料。 的良好材料。
第六章-微生物的生长及其控制PPT课件
繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
生长速率常数R=
代时G=
t2 -
3.322(lgx2-lgx1) t1 t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
2021
26
一些细菌的代时
菌名 培养基 培养温度
代时
E. coli（大肠杆菌） 肉汤
37℃ 17min
E. coli 牛奶
37 12.5
③调整培养基的成分，应适当丰富，且发酵培养基成分尽 量与种子培养基的成分接近。
2021
24
（二）指数期
1、特点： ➢ 生长速率常数R最大，即代时最短; ➢细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、 生理特征等比较一致; ➢酶系活跃，代谢最旺盛。
2021
25
2、指数期中的的 x2
三个重要参数
x1
t1 t2
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lg细胞数（个/ml）
连续流入 新鲜培养液
单批培养
连续培养
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单批培养 恒浊法
连续培养 恒化法
时间
40
1、连续培养器
按控制方式分 内控制（控制菌体密度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速、以控制 生长速率）：恒化器
连续
培养 器
按培养器的级数分
单级连续培养器 多级连续培养器
按细胞状态分 一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
2021
15
二、微生物的个体生长和群体的同步生长
➢ 使用同步培养技术，即设法使群体中的所有细 胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中， 然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了 解单个细胞所发生的变化。
➢ 通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致 的状态即同步生长。进行同步分裂的细胞称为 同步细胞。
第六章微生物生长繁殖及其控制PPT课件
5.比浊法
原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比， 即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分 光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌 液的浓度。
特点：快速、简便；但易受干扰。
6.生理指标法
▪测含氮量
蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主 要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。
一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌 为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25， 就可测得粗蛋白的含量。
▪其他方法
含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧 化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。
第二节 微生物的典型生长曲线
一、微生物培养 ：
研究群体生长规律，首先应对微生物进 行培养。培养的方法有： 分批培养和连续培养
毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微 生物。
显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢 子以获得纯培养。
小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在 显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的 分离。
二、微生物生长及测定方法
生长——微生物细胞吸收营养物质，进 行新陈代谢，当同化作用>异化作用时， 生命个体的重量和体积不断增大的过程。
小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）
个体生长个体繁殖 群体生长
群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
通常把一个细胞分裂成两个细胞所需要的时间，称为代时。
一些细菌的代时
菌名 培养基 培养温度
代时
E. coli（大肠杆菌） 肉汤
37℃
17min
E. coli 牛奶
第六章微生物的生长繁殖及其控制
第六章微生物的生长生殖及其操纵一、微生物生长生殖的概念微生物的生长是指细胞物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。
当细胞个体生长到一定时期，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加即生殖。
在高等生物里这两个过程能够明显分开，但对低等特别是单细胞的微生物，由于细胞小，这两个过程紧密联系、特别难划分，因此，微生物的生长生殖，一般指群体生长，这一点与研究动物、植物有所不同。
1、细菌一般没有有性生殖，多采纳二分裂方式。
2、真菌除了进行无性生殖，产生大量孢子如分生孢子、节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子等外，还能进行有性生殖，产生有性孢子如卵孢子、接合孢子、孢囊孢子等。
二、微生物生长的测定微生物生长：单位时刻里微生物数量或生物量〔Biomass〕的变化个体计数微生物生长的测定：群体重量测定群体生理指标测定〔一〕以数量变化对微生物生长情况进行测定通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长或样品中所含微生物个体的数量〔细菌、孢子、酵母菌〕。
1、培养平板计数法样品充分混匀后，取一定量的稀释液涂布或倾注在平板上，进行培养，统计平板上长出的菌落数。
注重：1）同一稀释度三个以上重复,取平均值；2）每个平板上的菌落数目适宜，便于正确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，因此在科研中一般用菌落形成单位〔colonyformingunits，CFU〕来表示，而不是直截了当表示为细胞数。
2、膜过滤培养法当样品中菌数特别低时，能够将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。
3、Themostprobablenumbermethod〔液体稀释法〕1〕未知样品进行十倍稀释；2〕取三个连续的稀释度平行接种多支试管并培养；3〕长菌的为阳性，未长菌的为阴性；4〕查表推算出样品中的微生物数目；4、显微镜直截了当计数法采纳细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直截了当计数，计算一定容积里样品中微生物的总数量。
第六章微生物的生长及其控制
第六章微⽣物的⽣长及其控制第六章微⽣物的⽣长及其控制1.概述⽣长:细胞物质有规律地,不可逆地增加,导致细胞体积扩⼤的⽣物学过程.繁殖:微⽣物⽣长到⼀定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定的⽅式产⽣新的⽣命个体，即引起⽣命个体数量增加的⽣物学过程。
⽣长是⼀个量变的过程，繁殖是⼀个质变的过程2.细菌的个体⽣长1.染⾊体DNA的复制和分离细菌的染⾊体为环形双链DNA分⼦。
染⾊体⼀双向的⽅式进⾏连续的复制，在细胞分裂之前不仅完成了染⾊体的复制，⽽且也开始了2个⼦细胞DNA分⼦的复制。
当细胞的⼀个世代即将结束时，不仅为即将形成的2个⼦细胞各备有⼀份完整的遗传信息，⽽且也具有已经按亲本⽅式复制的基因组。
其复制点附着在细胞膜上，随膜的⽣长和细胞分裂，2个未来的⼦细胞基因组不断地分离，最后达到2个⼦细胞中。
细菌在个体⽣长中通过染⾊体DNA的复制，使其遗传特性能保持⾼度的连续性和稳定性。
2.细胞壁的扩增细胞在⽣长过程中，细胞壁只有通过扩增，才能使细胞体积扩⼤。
3.细菌分裂的调节细菌进⼊分裂时期，此时在细菌长度的中间位置，通过细胞质膜内陷并伴随新合成的肽聚糖插⼊，导致横隔壁向⼼⽣长，最后在中⼼回合，完成⼀次分裂，将细菌分裂成2个⼤⼩相等的⼦细菌。
细胞在⽣长和分裂伴随细胞壁的裂解和闭合2个过程。
前者将细胞壁打开，有利于细胞壁物质插⼊；后者在新合成的细胞壁物质插⼊后的开⼝处重新闭合形成完整的细胞壁，以利于机体⽣存。
影响细菌的⽣长和分裂的主要因素是：转肽酶（催化2个肽聚糖的短肽链的链接）；D-Ala-D-Ala-梭肽酶（催化五肽转变为四肽）青霉素竞争性抑制转肽酶。
3. 细菌的群体⽣长繁殖1.⽣长的规律细菌以⼆分裂繁殖,即细胞核⾸先进⾏有丝分裂,然后细胞质通过胞质分裂⽽分开,形成2个相同的个体.分批培养:在封闭系统中对微⽣物进⾏的培养,既不补充营养也不移去培养物质，保持整个培养液体积不变的培养⽅式。
培养曲线：以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，依据不同培养时间⾥细菌数量变化，作出培养期间菌数变化规律的曲线。
第六章 微生物生长及其控制
第五节 有害微生物生长繁殖的控制
一、基本概念
防腐(antisepsis)：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止 或抑制霉腐微生物生长的一种措施 。比如:低温、缺氧、干燥、 高渗、高酸度、高醇度、加防腐剂等等。 消毒(disinfection)：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所 有病原微生物的一种措施。比如：巴氏消毒法 灭菌(sterilization)：指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内 的所有微生物的一种措施。包括杀菌和溶菌。比如：高压蒸汽 灭菌法 化疗(chemotherapy)：利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、 抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织、病变细胞进行治 疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无 毒害作用的治疗措施。以达到治疗传染病的目地。 四个概念的比较：p174表6-8
G = t1 - t0 /3.32(lgy - lgx) 特点：1）细菌个体形态、化学组成和生理特性等均 较一致2）代谢旺盛3）生长迅速、代时最短。 应用：研究微生物基本代谢、生理的良好材料。也常 在生产上用作种子
3.稳定期
表现： 新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，活菌数动态 平衡。 特点： 1）生长速率为0---动态平衡,细胞总数最高. 2）细胞内开始积累内含物 3）开始形成芽孢、次生代谢物 原因： 养分减少；有毒代谢物产生。 延长： 补料，调pH、温度等。
嗜冷微生物 兼性嗜冷微生物 嗜温微生物 嗜热微生物 超嗜热或嗜高温微生物
最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度
(二) PH
微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反 应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pH范围， 在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微 生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适 生长的pH范围。
第6章微生物的生长繁殖习题[整理]
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第六章微生物的生长繁殖及其控制习题填空题：1．一条典型的生长曲线至少可分为迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期 4个生长时期。
2．测定微生物的生长量常用的方法有单细胞计数、细胞物质的重量和代谢活性。
而测定微生物数量变化常用的方法有培养平板计数法、膜过滤法、液体稀释法和显微镜直接计数；以生物量为指标来测定微生物生长的方法有比浊法、重量法和生理指标法。
3．获得细菌同步生长的方法主要有(1) 机械法和(2) 环境条件控制法，其中(1)中常用的有离心法、过滤分离法和硝酸纤维素滤膜法。
4．控制连续培养的方法有恒浊法和恒化法。
5．影响微生物生长的主要因素有营养物质、水活性、温度、pH和氧等。
6．对玻璃器皿、金属用具等物品可用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法进行灭菌；而对牛奶或其他液态食品一般采用超高温灭菌灭菌，其温度为135-150~C，时间为2—6s。
7．通常，细菌最适pH的范围为6．5—7．5，酵母菌的最适pH范围为4．5～5．5，霉菌的最适pH 范围4．5—5．5。
8．杀灭或抑制微生物的物理因素有温度、辐射作用、过滤、渗透压、干燥和超声波等。
9．抗生素的作用机制有抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化和抑制蛋白质和核酸合成。
10．抗代谢药物中磺胺类是由于与对氨基苯甲酸相似，从而竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，使其不能合成叶酸选择题：1．以下哪个特征表示二分裂? ( (3) )(1)产生子细胞大小不规则 (2)隔膜形成后染色体才复制(3)子细胞含有基本等量的细胞成分 (4)新细胞的细胞壁都是新合成的2．代时为0.5h的细菌由103个增加到109个时需要多长时间?( (3) )(1)40h (2)20h (3)10h (4)3h3．某细菌2h中繁殖了5代，该菌的代时是( (2) )。
(1)15 min (2)24min (3)30min (4)45min4．代时是指( (4) )。
(1)培养物从接种到开始生长所需要的时间 (2)从对数期结束到稳定期开始的间隔时间 (3)培养物生长的时间(4)细胞分裂繁殖一代所需要的时间5．如果将处于对数期的细菌移至相同组分的新鲜培养基中，该批培养物将处于哪个生长期?( (4) )(1)死亡期 (2)稳定期 (3)延迟期 (4)对数期6．细菌细胞进入稳定期是由于：①细胞已为快速生长作好了准备；②代谢产生的毒性物质发生了积累；③能源已耗尽；④细胞已衰老且衰老细胞停止分裂；⑤在重新开始生长前需要合成新的蛋白质( (2) )。
微生物的生长繁殖及其控制
三、细菌的分裂与调节
各种物质复制后，质膜内陷伴随新肽聚糖插入， 各种物质复制后，质膜内陷伴随新肽聚糖插入，导致 横隔壁向心生长，最后会合，一分为二。 横隔壁向心生长，最后会合，一分为二。 对细菌生长与分裂起调节作用的主要是于转肽酶和 对细菌生长与分裂起调节作用的主要是于转肽酶和 D,D－羧肽酶活性比。 －羧肽酶活性比。 转肽酶活性高些，利于细胞壁扩增，导致细菌生长。 细胞壁扩增 转肽酶活性高些，利于细胞壁扩增，导致细菌生长。 羧肽酶高些，利于横隔壁形成， 羧肽酶高些，利于横隔壁形成，导致细胞分裂。
蛋白质含量测定法：从一定量培养物中分离出细菌， 蛋白质含量测定法：从一定量培养物中分离出细菌，洗 DNA含量测定法：利用 含量测定法： 含量测定法 利用DNA与DABA-2HCl(即新配制的 与 以除去培养基带入的含氮物质。 即新配制的 涤，以除去培养基带入的含氮物质。再用凯氏定氮法法 测定总含氮量。 测定总含氮量二氨基苯甲酸 盐酸溶液)能显示特殊荧光反 。 20%W/W，3，5-二氨基苯甲酸 盐酸溶液 能显示特殊荧光反 ， ， 二氨基苯甲酸-盐酸溶液 一般细菌的含氮量约为原生质干重的14%。故，蛋白质 。 一般细菌的含氮量约为原生质干重的 应的原理而设计的。因为每个细菌平均含DNA8.4×10-5纳克， 纳克， 应的原理而设计的。因为每个细菌平均含 × 总量=含氮量 含氮量%× 总量 含氮量 ×6.25 可根据DNA含量计算出细菌的数量。 故细胞总量＝蛋白质 含量计算出细菌的数量。 可根据 含量计算出细菌的数量 蛋白质含量占细菌总重的～ ％， ％，故细胞总量 蛋白质含量占细菌总重的～65％，故细胞总量＝ 总量× 总量×1.54
第六章微生物的生长繁殖与控制
第六章微⽣物的⽣长繁殖与控制南开⼤学⽣命科学学院微⽣物学课程教案授课时间见教学⽇历授课地点新阶-202 教学对象⽣物科学, ⽣物技术, 化学学院药学系章节第六章微⽣物的⽣长繁殖及其控制学时分配 2学时⽬的和要求本章主要使学⽣掌握微⽣物⽣长繁殖的规律，微⽣物⽣长的测定⽅法，及各种物理、化学因素对微⽣物⽣长的影响。
重点、难点单细胞⽣物典型⽣长曲线的特征，控制有害⽣物⽣长的⽅法，依据氧⽓、⽣长温度可将微⽣物分成的种类类型教学内容第⼀节细菌的个体⽣长与群体⽣长规律⼀、细菌个体⽣长1、细菌染⾊体双向复制2、细胞壁扩增3、细菌的⽣长与分裂调节⼆、细菌群体⽣长规律（⼀）细菌群体⽣长曲线（⼆）细菌群体⽣长的数学表⽰式三、连续培养四、同步培养第⼆节真菌的⽣长与繁殖⼀、丝状真菌的⽣长繁殖1、菌丝断裂繁殖2、⽆性孢⼦繁殖3、有性孢⼦繁殖4、丝状真菌的⽣活史⼆、酵母菌的⽣长繁殖第三节环境对⽣长的影响及⽣长的测定⼀、环境因⼦对微⽣物⽣长的影响1、营养因⼦对⽣长的影响2、⽔活性对⽣长的影响3、温度对⽣长的影响4、pH对⽣长的影响5、氧对⽣长的影响⼆、微⽣物⽣长测定1、个体计数法2、重量法3、⽣理指标法第四节微⽣物⽣长繁殖的控制⼀、控制微⽣物的化学物质1、抗微⽣物剂2、抗代谢物3、抗⽣素4、细菌对抗⽣素的耐药性⼆、控制微⽣物的物理因素第六章微⽣物的⽣长繁殖及其控制第⼀节细菌的个体⽣长与群体⽣长规律细菌⽣长：包括细菌物质增加，个体增⼤继⽽⼆分裂使细胞数量增加连续过程。
⼀、细菌个体⽣长1、细菌染⾊体双向复制复制时环状DNA附着在膜上，DNA边复制，壁、膜边⽣长，两套DNA分离后，细胞出现横隔壁，细胞分裂。
2、细胞壁扩增细胞壁扩增位点（肽聚糖⽣长点）球菌：新合成的肽聚糖在⾚道板附近插⼊实验证明：粪链球菌（壁抗原）免疫动物壁抗体＋荧光素壁荧光抗体杆菌：Bacillus subtilis新壁（新⽣肽聚糖）多间隔位点插⼊3、细菌的⽣长与分裂调节⽣长与分类伴随壁的裂解和闭合聚糖主链裂解酶、闭合酶肽链间解交联酶：内肽酶肽链交联相关酶：D.D－羧肽酶、转肽酶⽣长的细胞：羧肽酶活性低转肽酶活性⾼细胞分裂：羧肽酶活性⾼转肽酶活性低⼆、细菌群体⽣长规律（⼀）细菌群体⽣长曲线（growth curve）1、群体⽣长规律实验细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以E.coli菌体数量的对数（或O.D值）为纵坐标，得到的⼀条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线叫E.coli⽣长曲线迟缓期（lag phase）将少量菌种接⼊新鲜培养基后，在开始⼀段时间内菌数不⽴即增加或增加很少，⽣长速度接近于零，细胞适应环境，酶合成迅速，为物质合成做准备。
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第六章微生物的生长繁殖及其控制计划学时：5重点：细菌生长曲线的定义、各时期的特点、应用及生产指导意义。
控制微生物生长繁殖及控制微生物生长的条件及原理。
第一节细菌纯培养的群体生长规律一、细菌纯培养的群体生长规律以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到如图6-6的曲线，称为繁殖曲线根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、调整期或滞留适应期。
（一）延迟期处于延迟期细菌细胞的特点可概括为8个字：分裂迟缓、代谢活跃。
延迟期出现的原因，可能是为了调整代谢。
延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关。
在生产实践中，通常采取的措施有增加接种量，在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分，采用最适种龄(即处于对数期的菌种)的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施，以缩短延迟期，加速发酵周期，提高设备利用率。
(二) 对数期(log phase)对数期又称指数期(exponential phase)。
在此期中，细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有分裂形成的新细胞都生活旺盛。
这一阶段的突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。
处于对数期的微生物，其个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，所以是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子，如果用作菌种，往往延迟期很短以至检查不出，这样可在短时间内得到大量微生物，以缩短发酵周期。
(三) 稳定期(stationary phase)又称恒定期或最高生长期。
处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。
稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。
生产上常常通过补料、调节pH、调整温度等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。
(四) 衰亡期(decline hpase)稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了"负生长"，此阶段叫衰亡期。
二、微生物生长的测定测定生长量的方法很多，概括起来有以下几种。
(一) 直接计数法(又称全数法)1. 涂片染色法2.计数器测定法用特制的细菌计数器或血球计数器进行计数。
取一定容积稀释的单细胞微生物悬液置于计数器载玻片与盖玻片之间的计数室内。
由于计数室的容积是己知的(总面积为1平方毫米，高0.1毫米)，并有一定刻度。
因此，可根据计数器刻度内的细菌数，计算出样品中的含菌数。
3.比例计数法将待测的细菌悬液与等体积血液混合后涂片，在显微镜下可以测得细菌数与红细胞数的比例。
4.电子自动计数器计数法电子计数器的工作原理，就是测定一个小孔中液体的电阻变化。
5.比浊法是测定悬液中细胞数的快速方法。
其原理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。
菌体是不透光的，光速通过菌悬液时则会引起光的散射或吸收，从而降低透光量。
细菌越多，透光量越低。
因此，测定菌悬液的光密度或透光度可以反映细胞的浓度。
(二) 间接计数法(又叫活菌计数法)1.平皿菌落计数法像稀释平皿分离法一样，先将待测菌液作一系列10倍稀释，使平皿上长出的菌落数在30-300个之间。
平皿菌落计数法是教学、生产、科研中最常见的一种活菌计数法。
2.稀释法待测样品作一系列稀释，一直稀释到该稀释液的少量(如1毫升)接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度(即临界级数)，再用"或然率"理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
(三) 测定细胞物质量1.测定细胞总含氮量来确定细菌浓度其方法要点：从一定量培养物中分离出细菌，洗涤，以除去培养基带入的含氮物质。
再用凯氏定氮法法测定总含氮量，以表示原生质含量的多少。
一般细菌的含氮量约为原生质干重的14%。
2.DNA含量测定法利用DNA与DABA-2HCl(即新配制的20%W/W，3，5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液)能显示特殊荧光反应的原理而设计的。
3.测定细胞干重法单位体积培养物中，细胞的干重可用来表示菌体的生长量。
4.基他生理指标测定法三、连续培养最简单的连续发酵装置包括：培养室、无菌培养基容器以及可自动调节流速(培养基流入，培养物流出)的控制系统，必要时还装有通气、搅拌设备。
控制连续培养的方法主要有两种：(一)恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法叫恒浊连续培养，如图6-7，A。
在恒浊连续培养中装中浊度计，借光电池检测培养室中的浊度(即菌液浓度)，并由光电效应产生的电信号强弱变化，来自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。
(二)恒化连续培养控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，培养室中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率，故称恒化连续培养，又叫恒组成连续培养。
恒化连续培养的培养基成分中，必须将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子。
能作为恒化连续培养的限制因子的物质很多。
这些物质必须是机体生长所必需的，在一定浓度范围内能决定该机体生长速率的。
常用的限制性营养物质有作为氮源的氨、氨基酸；作为碳源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；以及生长因子、无机盐等。
恒化连续培养方法，多用于微生物学的研究工作中。
连续培养法用于工业发酵就称为连续发酵(continuous fermentation)。
我国已用于丙酮-西醇的发醇生产中，缩短了发酵周期，效果良好。
四、同步生长能使培养的微生物处于比较一致的，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法；利用上述实验室技术控制细胞的生长，使它们处于同一生长阶段，所有的细胞都能同时分裂，这种生长方式叫同步生长；用同步培养法所得到的培养物叫同步培养或同步培养物。
获得同步培养的方法很多，最常用的有以下几种：(一)机械法 (又称选择法)1.离心沉降分离法2.过滤分离法3.硝酸纤维素薄膜法A.将菌液通过硝酸纤维素薄膜，由于细菌与滤膜带有不同电荷，所以不同生长阶段拓细菌均能附着于膜上；B.翻转薄膜，再用新鲜培养液滤过培养；C.附着于膜上的细菌进行分裂，分裂后的子细胞不与薄膜直接接触，由于菌体本身的重量，加之它所附着的培养液的重量，便下落到收集器内；D.收集器在短时间内收集的细菌处于同一分裂阶段，用这种细菌接种培养，便能得到同步培养物。
(二)调整生理条件的同步法1.温度调整法将微生物的培养温度控制在亚适温度条件下一段时间，它们将缓慢地进行新陈代谢，但又不进行分裂。
2.营养条件调整法即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。
(三)抑制DNA合成法DNA的合成是一切生物细胞进行分裂的前提。
利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除其抑制，也可达到同步化的目的。
第二节物理、化学因素对微生物生长与死亡的影响消毒是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。
灭菌是指用物理或化学因子，使非于物体中的所有生活微生物，永久性地丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢。
这是一种彻底的杀菌措施。
化疗是指利用某些具有选择毒性的化学药物(如磺胺)或抗生素，对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却没有或基本上没有损害。
一、温度温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一。
它对生活机体的影响表现在两方面：一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快。
在一般情况下，温度每升高10℃，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。
就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生在零下12-100℃均可生长。
而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。
各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。
最低生长温度是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。
处于这种温度条件下的微生物生长速率很低，如果低于此温度则生长完全停止。
不同微生物的最低生长温度不一样，这与它们的原生质的物理状态和化学组成有关系，也可随环境条件而改变。
最适生长温度使微生物迅速生长繁殖的温度叫最适生长温度。
不同微生物的最适合生长温度不一样。
应该着重指出：最适合生长温度不一定是一切代谢活动的最好温度。
其他微生物的试验也得到了类似的结果。
微生物按其生长温度范围可分为低温微生物、中温微生物和高温微生物三类。
(一)低温型微生物又称嗜冷微生物，可在较低的温度下生长。
它们常分布在地球两极地区的水域和土壤中，这里大部分地区几乎终年冰冻，即使在其微小的液态水间隙中也有微生物的存在；它们或者分布在平均温度为5℃左右的海洋中，或分布在只有1-2℃的海洋深处；有的分布于冷泉。
冷藏食物的腐败往往由这类微生物引起。
低温微生物可分为专性嗜冷和兼性嗜冷两种。
专性嗜冷微生物的最适生长温度是15℃或更低，最高生长温度约为20℃，可在零度以下甚至零下12℃的环境中生长。
它们分布在常冷的环境中，即使短时受热以至室温条件，都会很快被杀死。
由于低温对微生物具有抑制或杀死作用，故低温保藏食品已是最常用的方法。
(二) 中温型微生物绝大多数微生物属于这一类。
最适生长温度在20-40℃之间，最低生长温度10-20℃，最高生长温度40-50℃。
它们又可分为室温性微生物和体温性微生物。
(三)高温型微生物它们适于在45-50℃以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限制于某些地区，如温朱、日照充足的土壤面、堆肥堆、发酵饲料等腐烂有机物中，比如堆肥在发酵过程中温度常高达60-70℃。
高温型微生物能在如此高的温度下生存和生长，可能是由于菌体内的酶和蛋白质比起中温型微生物更能抗热，尤其蛋白质对热更稳定；同时高温型微生物的蛋白质合成机构--核糖体和其他成分对高温也具较大的抗性；更明显的是，细胞膜中饱和脂肪酸含量高，它比不饱和脂肪酸可以形成更强的疏水键，从而使膜在高温下能保持其稳定性并具正常的功能。
如果超过了最高生长温度则导致微生物死亡。
不同微生物的致死温度不同。
但以细菌芽孢抗热性最强，100℃以下处理相当时间才能致死。
各种芽孢的抗热能力不同。
高温致死微生物主要是引起蛋白质和核酸不可逆的变性，或者破坏了细胞的其他组成，或者可能因为脂肪膜被热溶解而形成了极小的孔，使细胞内含物泄漏而引起死亡。
高温致死微生物的作用，现已广泛用于消毒灭菌，高温灭菌的方法分为干热与温热两大类。
在一温度下，湿热灭菌比干热法好。
例如肉毒梭状芽孢杆菌，采用湿热灭菌法121℃经10分钟即可杀芽孢。
如果在干燥状态下，用热空气杀菌，则需180℃10分钟才能杀死。