斑马鱼在新药药理毒理方面的研究_梁爽

中山大学研究生学刊(自然科学、医学版)

第30卷第3期　J O U R N A LO FT H EG R A D U A T E S　V O L.30№3

2009　S U NY A T-S E NU N I V E R S I T Y(N A T U R A LS C I E N C E S、M E D I C I N E)　2009

斑马鱼在新药药理毒理方面的研究＊

梁　爽

(中山大学生命科学学院,广州510275)

【内容提要】斑马鱼作为一种新的模式动物,已经在新药的药理和毒理研究

方面得到了广泛的应用。随着基因学和胚胎学的发展,证明了斑马鱼的生物学

特性接近于人类生长全过程,使其在人类疾病研究等方面表现出重要的作用。

本文阐述了斑马鱼的特点,以及其应用于人类疾病模型和药物药理毒理方面的

成果和前景。

【关键词】斑马鱼;模式动物;药理;毒理

斑马鱼(D a n i o r e r i o)俗称蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼,隶属鲤科、短担尼

鱼[1],是一种热带观赏鱼,因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。产于孟加拉和印度等国。斑马鱼成鱼体型较小,体长4～6厘米,胚胎透明且体外发育,易于活体观察;生长发育快,受精后24小时主要器官原基基本形成,便于研究组织器官的发育和功能;2～3个月可长成成鱼,繁殖能力强且易于饲养,单独一对成年的鱼一星期就可以繁殖一次,雌鱼每周可产卵200～300枚,可快速获得大量胚胎[2]。斑马鱼的特点使其早在20世纪30年代,就作为经典的生长和胚胎模型。在20世纪70年代开始受到科学家们的关注,并成为最重要的模式脊椎动物之一[3]。S t r e i s i n g e r等( 1981)在“N a t u r e”上发表了斑马鱼的体外受精技术、单倍体诱导技术,建立了纯合品系,并介绍了斑马鱼的第一个自然突变体—g o l d e n,这是斑马鱼成为模式动物新宠的开端[4]。自20世纪90年代初以来,斑马鱼因其多方面的优点已成为模式动物家族中重要的一员,受到越来越多的重视和利用。

斑马鱼由于发育前期细胞分裂快,胚体透明,特定的细胞类型易于识别等有利因素,成为脊椎动物中最适于做发育生物学和遗传学研究的模式生物[5]。很多致力于用胚胎和基因处理疾病模型的研究者都转而对斑马鱼产生了兴趣。随着今年来的研究发现,斑马鱼虽然不是哺乳动物,但是随着斑马鱼基因技术得到了发展,如克隆,转基因技术,诱变和绘制方法,以及斑马鱼基因组测序工程的完成,发现斑马鱼的基因与人类的基因保守度达到85%,使得斑马鱼后来居上成为了新一代的人类疾病模型。

＊收稿日期:2009-09-17

作者简介:梁爽,女,中山大学生命科学学院药理学2008级硕士研究生,研究方向:天然药物药理;E-m a i l:c o l d v i v i@126.c o m.

　斑马鱼在新药药理毒理方面的研究

1　斑马鱼的优点

1.个体小(成体长3～5c m),一个盛3升水的鱼缸可养殖20—30尾成鱼。物种稳定,个体差异性小,雌雄鉴别较容易。雄鱼的蓝色条纹偏黄,间以柠檬色条纹;雌鱼的蓝色条纹偏蓝而鲜艳,间以银灰色条纹,身体比雄鱼丰满粗壮,尤其性成熟雌体腹部膨大。雄鱼的体长体高比大于雌鱼的体长体高比[6]。

2.发育快速,性成熟期短,繁殖能力强(成熟雌鱼每隔一周可产卵数百粒)。在受精24h后,斑马鱼主要的组织器官原基已形成,各个脑室、眼睛、耳、血细胞、体节等均清楚可见,相当于28d的人类胚胎。在合适的养殖条件下,斑马鱼的性成熟期一般为3个月左右。雌雄鱼的交配行为受光刺激,可以通过调控光周期或控制雌雄鱼的接触而控制产卵时间。一尾雌鱼一般每次可产100—300枚,每周可产卵一次。由于其便于大规模养殖,可持续提供大量分析材料,因此可以用于人工诱变和突变体的筛选[7],成为目前唯一可以进行大规模随机诱变筛选隐性突变体的脊椎动物[8]。

3.卵和胚胎透明,体外受精,体外发育,易于观察。卵子比一般哺乳动物卵子大十倍,受精卵的直径约1m m,易于进行显微注射和细胞移植等操作,便于在不受损害情况下,进行细胞发育命运的连续跟踪观察和细胞谱系的分析。

4.与哺乳动物模型生物相比斑马鱼模型具有极大的优点,斑马鱼的胚胎很小,每次测定只需要很少量的样品,而且筛选可以在96孔微板上进行,每孔只需要100微升水。由于斑马鱼胚胎有可以提供营养的卵黄,因此第一周内不需要任何喂食。用药也很简单,小分子化合物可以溶于水中并扩散到胚胎中[6]。

5.胚胎学和遗传学操作技术成熟。在基因功能研究方面,已发展了转基因技术、基因过量表达技术、利用反义寡核苷酸抑制基因表达的技术、随机及靶基因定向诱变的技术、体细胞克隆技术等[7]。

6.基因组全系列测定已经完成。斑马鱼基因组测序工作开始于2001年,其基因组序列的破译极大地推动了功能基因组学的研究。

7.科学家发现,斑马鱼的脑部神经元较为简单和可预测,并发现斑马鱼脑中的许多神经元的排列简单而有规律,可用来建立筛选治疗人类疾病药物的模型,用于化学物品和毒理学研究。

8.斑马鱼的品系资源十分丰富,目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为T u e b i n g e n品系、A B品系、W I K品系,斑马鱼基因组计划所用品系是T u e b i n g e n。此外,保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。

2　斑马鱼的应用

2.1　斑马鱼应用于人疾病模型

斑马鱼的基因组中含有约30000个基因,这个数目与人差不多,而且它的许多基因与人体存在一一相应的关系,更为难得的是:斑马鱼的肿瘤情况与人极为类似。在这些方面,斑马鱼作为一种理想的分子生物学模式生物,拥有其他脊椎动物所无法相比的优点。

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2.1.1　癌症

斑马鱼能像人类一样患癌症,遗传背景相对简单,其体内的致癌基因、肿瘤抑制子等与肿瘤相关基因也与人类有高度的保守性。通过诱变基因或细胞移植的方法可使斑马鱼罹患癌症,且患有癌症的斑马鱼与同类正常鱼杂交产生的后代也具有癌症的表型[8]。斑马鱼体内和人体内的肿瘤在组织学上的相似性使得这些肿瘤模型在其相应人类疾病的研究中有着重要的意义。在斑马鱼身上观察到各种各样的肿瘤,无论是自发产生的还是随后加入致癌物产生的。比如N-甲基-N-硝基鸟苷诱导间质肿瘤。特殊的肿瘤也通过转基因遗传产生。比如,在淋巴细胞中c-m y c基因的过度表达,在一些鱼身上发展成白血病。通过转基因耦合绿色荧光蛋白,为肿瘤生长的可视化提供了便利。虽然由于斑马鱼没有肺,胸腺和前列腺,限制了一些癌症模型的建立,但是很多抑制的靶点在斑马鱼身上已经确认,而且用遗传学方法确定了新的靶点。前不久,L a n g e n a u等将鼠源性的c-m y c基因(该基因对人体白血病和淋巴瘤的发生有着重要影响)与一个存在于斑马鱼淋巴细胞内的基因R a g2启动子相融合,再将融合基因的末端连上G F P基因,随后将三基因的嵌合体注射到斑马鱼的胚胎细胞中,使所有的鱼体细胞都包含有这种融合基因,从而建立起了白血病模型。通过观察发现,白血病细胞首先出现在胸腺(胸腺与免疫系统的发育有关),随后逐渐扩散到胸腺附近的腮和眼睛后面的组织,再进一步扩散至骨骼肌和腹内器官。这个模型有利于研究人员弄清楚某种基因是加快还是减缓T细胞急性成淋巴细胞白血病,同时这种模型还能够更快速、更直接的检验药物治疗这种疾病的效果[9],而且斑马鱼有很大的潜力用于寻找新的治疗方向和治疗方法。斑马鱼基于一种疾病的基因筛选的成本和费用不像用小鼠那么令人望而却步,因此必将成为新一代的用于建立癌症模型的动物。

2.1.2　神经系统疾病

斑马鱼为复杂的影响行为的综合神经功能的遗传学研究提供了机会。在药动学中改变人体的突触传递和神经细胞膜稳定,与斑马鱼的活动相似,表示在这些生物体中存在着相类似的神经网络。虽然小鼠的认知功能已经众所周知,但是因为需要基因筛选,使得很难大规模的去实施,斑马鱼最大的作用就在这里。众所周知,斑马鱼显示与许多医学行为相关,越来越多的酶作用物特性被发现。比如斑马鱼睡觉的行为特性已经达到解剖药理水平。另外,研究人员在斑马鱼体内发现了与神经嵴疾病相关的P h o x2b基因和对帕金森疾病有影响的U C H-L1基因,且与其人类同源基因具有高度保守性[10],该发现为神经嵴疾病和帕金森疾病的研究开辟了新的途径。

2.1.3　心脏疾病

斑马鱼的胎心在受孕3周时表现出类似于人胚胎的心脏,分为心房,心室,房室之间有瓣膜[11]。而且其胚胎和鱼苗透明,运用分子标记物如绿色荧光蛋白可对心脏方便快速地进行活体直接观察。对心脏发育过程中基因表达调控的研究有助于人们找到这些疾病的根源,找到重要的药物靶标,指导预防干预先天性心脏病发生或者心血管疾病的治疗。目前对于心脏发育的研究已经深入分子研究的层次。构建转基因鱼系作为研究的工具,同时大量突变体的获得也为更进一步深入研究心脏发育的分子机制提供了方便和可能[12]。

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