流式细胞仪原理及软件介绍

90 Degree Scatter
Forward Scatter Projection
Neutrophils
Forw ard Scatter
800
光路-荧光信号

每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会 有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射 波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些 光学信号
光路构造
光
光源
路
检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光)
荧光信号 荧光染料 光学滤片
光

路
光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光
空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列
分类

分析型：只能分析用，液流进入废液筒 分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管 道绝对无菌。
基本原理
流路（液流系统）

流动室

鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路（光学系统）


光源 滤片 光电倍增管PMT HV
电路（电路系统）

放大电路HV及GAIN 增益

滤片

带通滤片 BAND Βιβλιοθήκη BaiduASS (BP)

只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
Transmitted Light

二向色性滤片 DICHROIC FILTER

620 -640 nm Light
一定波长以上通过，该波长以下折射

A/D转换
分析系统：计算机
流路构造
流

路
单细胞悬液
大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细 胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦


FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam

荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING)
•发射波长(EMISSION)
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
FITC PE(RD1) 488 488 525 575
用途
免疫荧光 免疫荧光
颜色
绿色 橙色
ECD
PeCy5 PI PECy7 PerCP
488
488 488 488 488
分析系统

以FC500机型的CXP软件介绍

常用激光器及其通道分配表
检测信号
散射光信号—前向散射光(FS)

FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小
Beckman Coulter Celllab Family
EPICS XL-ADC
QUANTA SC
Gallios/Navios MoFlo XDP
Cytomics FC500
Cyan ADP
FC500硬件
What is flow cytometry?
流式细胞术是单个细 胞/颗粒流过检测装置 过程中，检测到的物 理和/或化学的特性。 Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition
CD8-PE
CD8-ECD
CD8-PC5
CD8-PerCP
CD8-APC
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)
光路 - 滤片特性
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg
Light Source
Transmitted Light
Reflected light
Optics - Detectors

Photomultiplier tube (PMT)

将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程
620
675 620 755 670
免疫荧光
免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙红
红 橙红 深红
APC
633
670
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
荧光染料比较(平均荧光强度)
Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统
CD8-FITC
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及软件介绍
Beckman Coulter流式细胞仪发展史






1947年Wallace Coulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析 1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A 1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICS II 1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪 1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICS XL/MCL 2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（Advanced Digital Compensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动 补偿和脱机补偿时代 2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级 为FC500/MPL 2006年推出世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞 分析系统Quanta SC， 将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出 MPL进样系统 2007年收购Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成为高端流式市场的 领导者 2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/Navios


前向散射光
Laser
FALS Sensor
前向散射光
散射光信号 – 侧向散射光

SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称 为90度散射光检测器
SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比

侧向散射光
Laser
FALS Sensor

长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过
短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过


光路 - 滤片特性

当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波 长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光
这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter)
90LS Sensor
侧向散射光
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
1000
Scale
1000 200 50 40 20 15 8
200 400
600
100
30
Monocytes Lymphocytes
0
0 200 400 600 800 1000
Single
Parameter Histogram: Count vs MFI
Immunophenotyping
15
Count
11
7
3
0
0
0
0
0
.1
1
10
100
1000
Log FITC
Single Parameter Histogram
Dual Parameter Histograms
Dual Parameter Histograms