GUS染色技术在遗传学实验教学中的应用

第17卷第4期2019年8月

VoL.17No.4

Aug.2019

实验科学与技术

Experiment Science and Technology

Gt/S染色技术在遗传学实验教学中的应用

王晓雯I,李先碧彳，张建奎I,张建I,桑贤春I

(1.西南大学农学基础实验教学中心，重庆北5S400715; 2.西南大学生物技术中心，重庆北5S400715)

摘要为提高教学质量，针对单基因调控性状的孟德尔分离规律，该文提出了利用外源报告基因Gus染色技术验证遗传分离规律的教学构思。实践表明，该实验不仅让学生掌握了分子层面遗传规律检验技术，而且普及了外源基因的鉴定方法，是科研成果转化为实验教学的一次成功探索。

关键词Gus染色技术；遗传学实验；孟德尔分离规律；教学设计

中图分类号G642文献标志码 A doi:10.3969/j.issn.l672-4550.2019.04.020

Application of GUS Staining Technique in the Teaching of

Genetics Experiment

WANG Xiaowen1,LI Xianbi2,ZHANG Jiankui1,ZHANG Jian1,and SANG Xianchun1

(1.Agronomy Experimental Teaching Center,Southwest University,Beibei400715,China;

2.Biotechnology Research Center,Southwest University,Beibei400715,China)

Abstract In order to improve the experiment teaching quality of the Mendelian segregation law of qualitative character heredity regulated by single major gene,the teaching conception of using exogenous reporter gene GUS to verify the genetic rules was pro­posed.The experiment not only checks up Mendel*s law of segregation on the molecular level,but also provides investigated method of exogenous genes.Therefore,the experiment is a successful exploration of scientific achievements in genetic experimental teaching.

Key words GUS staining technique;genetics experiments;mendelian segregation law;instructional design

遗传学是研究生物的遗传变异及其规律的一门实践性很强的学科⑴。作为生命学科的基础，与生物统计学、分子生物学等多个学科的内容相互交叉渗透，形成了你中有我，我中有你的局面，因此学 好遗传学对相关课程的理解有极大的帮助4現遗传学实验是遗传学的重要组成部分，主要通过具体的操作、观察和分析，使学生更容易理解和领会遗传学的概念和原理，在整个本科生教学中发挥了重要作用。其中，孟德尔分离定律是遗传教学中的最重要的实验之一。传统的遗传学实验教学主要采用玉米籽粒、果蝇作为实验材料进行简单的遗传规律检验31。玉米在开花授粉期间易受不良外界环境影响，产生秃尖、缺粒、籽粒不饱满等异常现象，另外，使用久了易磨损并产生色差，这些都严重影响了实验结果的观察国。果蝇发育不仅受温度等环境因素影响大，而且因为生活周期长，约10~14天，也制约了其在实验教学中的应用切。近来也有报道可利用水稻叶色突变体进行遗传规律的验证3〕，但由于水稻叶色突变体的表型观察常常需在3叶期之后进行，即约14天之后。由于高等院校每次实验课时常只有2~3学时，导致玉米、果蝇和叶色突变体为实验材料的实验因周期过长很难在有限的课时内开展。报告基因GC7S的染色技术所需实验材料不受外界环境影响，实验周期短，性状易观察，不仅完全能满足有限的实验课时要求，而且相对玉米籽粒提高了实验的动手能力，增加了实验乐趣，非常适合教学的需要。

为了实验简单易懂、操作方便，本文提出了利用外源报告基因GUS染色鉴定烟草萌发种子，进而验证孟德尔分离规律的实验。不仅使基因的概念及孟德尔分离规律更直观化、形象化，也为学生打开了分子生物学技术验证遗传规律的思路。

收稿日期：2018-03-06;修回日期:2018-07-12

基金项目：中央高校基本科研业务费一般项目(XDJK2015CU7)o

作者简介：王晓雯(1975-),女，博士，高级实验师，主要从事遗传学教学与研究方面的工作。

通信作者：桑贤春(1978-),男，博士，副研究员，主要从事分子遗传育种学的研究工作。E-mail：sangxianchun@

第17卷第4期王晓雯，等：GU5染色技术在遗传学实验教学中的应用•93•

1报告基因Gt/S的应用

1.1报告基因GUS的作用机理

GUS基因存在于一些细菌基因组内，如大肠杆菌K12、葡萄球菌等，编码0-葡萄糖昔酸酶3。由于绝大多数植物细胞内不存在内源性的葡萄糖昔酸酶活性，因此这个基因广泛用作转基因植物的报告基因2。用含有底物(X-Gluc)的缓冲液浸泡被检材料，若转GUS基因的组织细胞能表达出GUS,即0-葡萄糖昔酸酶，在适宜的条件下，该酶可将X-Gluc水解，产生无色的H引嗥氧基中间物，再经氧化二聚化作用形成不溶的深蓝色染料，使具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色，可宜接肉眼观察或在显微镜下观察是否GUS基因表达"2皿。

1.2报告基因GUS在遗传学实验中的应用

1.2.1GUS染色进行孟德尔遗传分离规律验证的原理

GUS基因的表达产物为0-葡萄糖昔酸酶，在GUS染液的作用下生成深蓝色物质。35S启动子来自花椰菜花叶病毒(CaMV),具有全生育期高表达特性，广泛用于植物转基因功能验证；当GC7S基因置于35S启动子后构建植物表达载体，利用农杆菌介导法等技术导入植物体中后，相当于植物体多了一个单显性基因。利用含有GUS基因的纯合株系与无GUS基因的材料杂交，正反交结果相同，其片世代应为GUS基因的杂合体纯系，F?世代则会分离出4种类型，分别为GUS/GUS、GUS/gus、gus/ Gt/S和g诫叫由于GUS为显性基因，前3种类型都应该GE7S染色变蓝，蓝色和非蓝色的比例理论上应该为3：1,从而验证了孟德尔遗传分离规律。

1.2.2技术流程

取GUS基因的转基因材料的T。代种子，如无T。代种子，可以用纯合Gt7S基因植株与野生型杂交的F2代种子替代，室温萌发，进行GUS组织化学染色，统计蓝色种子和非蓝色种子的比例并进行卡方检验，若符合3：1,则证明该性状由单基因调控"切。

2报告基因Gt/S染色技术的教学设计

在实验教学过程中，先进行基因概念和孟德尔遗传规律的复习，然后利用动画、录像和虚拟实验等模拟植物基因组DNA提取、外源DNA与质粒载体的连接、植物表达载体构建、农杆菌介导的烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi.)遗传转化等实验，使学生充分了解转基因流程。然后，利用恒温光照培养箱催芽烟草种子，进行GUS染色，统计分析鉴定孟德尔分离遗传定律，具体操作如下。2.1实验材料与方法

2.1.1实验材料

T。代转基因烟草种子由科研实验室西南大学生物技术中心赠送。

2.1.2GUS染色

GUS染色参考文献［18］描述的方法进行。

1)在28七的恒温培养箱内，将T。代转基因烟草的种子放入垫有2层滤纸的培养皿内，保湿培养2天左右，出现萌动后取出。

2)配制GUS工作液，方法如表1所示。Na2-EDTA即乙二胺四乙酸二钠，低毒，对粘膜和上呼吸道有刺激作用；铁氤化钾K3Fe(CN)6是一种氧化剂，遇阳光或溶于水都不稳定，吸入、摄入或经皮肤吸收对身体可造成伤害，随意丢弃可污染水资源；亚铁氤化钾K4Fe(CN)6中由于氤离子与铁牢固结合，故其毒性较低。使用这些药品配制GUS 溶液时，除常规的穿实验服外，还应佩戴乳胶手套、防毒口罩，并在通风橱中操作，配制好的GUS 工作液应用锡箔纸包裹-20七避光保存。

表1GUS工作液组分及配制方法

注：充分混匀，-201避光保存。

成分250mL体系用量

10mg/mL X-Gluc溶液10mL

0.25mol/L pH&0Na2-EDTA溶液10mL

25mmol/L K3Fe(CN)6溶液5mL

25mmol/L K4Fe(CN)6溶液5mL

Triton-XlOO12.5mL

Bu任er缓冲液207.5mL

3)取1.5mL离心管3支，放入萌发的T。代转基因烟草种子，约100粒左右。

4)加入适量GC7S工作液，应使萌发的烟草种子完全浸入在GUS工作液中，并用真空渗入法帮助底物渗入细胞。

5)37T恒温培养箱中保温30min。

6)倒掉GUS工作液，加入75%乙醇脱色2次,每次约30min,至无色的烟草根尖呈白色。

7)肉眼观察染色情况，拍照并统计。

2.1.3生物统计分析

分别统计蓝色和非蓝色种子数目，利用才测验进行统计分析［19］o

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