第五章(附)限制性内切酶

The majority of incoming phage genomes are
recognized by the restriction endonucleases (999 out of 1000) while only the rare infection (1 in 1000) is methylated before it is recognized by the host restriciton enzymes. Once methylated however, all subsequent phage genomes are efficiently methylated at hemimethylated sites on replication. This explains the high efficiency infection with the individual plaques that escaped restriction.
限制-修饰（R-M）系统
限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ甲基化
酶）出现。后者的作用是保护细胞自身DNA不 被限制性内切酶破坏。修饰酶识别位点与相应的 限制性内切酶相同，但只甲基化每条链中的一个 碱基，甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍 了限制性内切酶的作用。限制性内切酶和它的甲 基化酶一起构成了限制-修饰（R-M）系统。 在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两 种不同的蛋白，各自独立行使自己的功能；而在 另一些系统中，两种功能由同一种酶的不同亚基， 或是同一亚基的不同结构域来执行。
The numbers of bases will determine the frequency of that specific sequence in an average DNA sequence. For example, DpnI recognizes a 4 bp sequence with would occur once every 44 or 256 bp. PvuI recognizes a 6 bp sequence with would occur once every 46 or 4,096 bp. NotI recognizes an 8 bp sequence with would occur once every 48 or 65,536 bp.
表1中所列仅是第一轮接种效率。如果将那些 10-4幸存者的后代噬菌体再接种到第一轮同样 的E.coli菌株中，如λ K→B→B，则接种效率 也为100％，然而，如果将万分之一幸存者的 后代接种到祖辈噬菌体的寄主菌株中心, λ K → B → K，则接种效率也成为10-4 ，为什么?
Answer: 幸存者的后代因为有
限 制 性 内 切 酶
细菌可以抵御病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细 胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。
一、限制-修饰现象的发现
表1
从表1可看出，从三种不同的E.coli菌株中 繁殖出来的λ噬菌体的后代(分别用λK、λ B 、
λC表示)，再接种到同样菌株，接种效率都是
1。
识别序列的对称性意味着这些位点的两条DNA
链上均有可被甲基化的碱基.实际存在的状态有三种：
全甲基化(两条链上都有甲基化碱基)，半甲基化(只
有一条链上有甲基化碱基)，非甲基化(识别位点上
没有甲基化碱基)。全甲基化的位点既不被限制;而
半甲基化的位点也不被限制，但可以被修饰,成为全
甲基化状态。非甲基化的位点在体外试验中既可作
来源不同的限制酶却识别和切割相同的 序列，这类限制酶称为同裂酶。
Restriction endonucleases that recognize the same sequence are isoschizomers.识别
对表1的解释：

不同的菌株可能有不同的限制修饰系统。 当不同来源的噬菌体λ进入另一种大肠 杆菌时，绝大部分被限制酶所降解，但 有极少数的入噬菌体先被大肠杆菌的甲 基化 酶所修饰，因而幸存下来.

大肠杆菌C株没有限制酶，因而其他来源的λ 可以感染C株，而C株来源的λ不能感染K株 和B株。这样，细菌借助于限制—修饰系统， 就能区别自我DNA和外源DNA。
二、 限制性内切酶
首批被发现的限制性内切酶包括来源于大 肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于 Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。这 些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接 的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基 因组成、功能及表达非常有用的工具。
事实上，有些菌株的细胞染 色体并没有限制—修饰系统的基 因，其限制修饰系统是由其中的 质粒或噬菌体的基因所编码的。 因此有的不同菌株的差别不在于 细菌本身，而在它所含的质粒或 噬菌体的不同。
We can envision two types of methylation events.
The first involves the methylation of host genome sequences after they have replicated. The two daughter genome molecules contain one methylated strand (the parental template strand) and one newly synthesized strand . These hemi-methylated sites are very efficiently methylated by the host modification enyzmes. The secont type involve the methylation of completely unmethylated sites. Unmethylated sites may occur during very rapid cell division - but they are normally rare. De-novo methylation of totally unmethylated sites is an extremely inefficient process. This accounts for the low efficiency of phage infection in a new host strain.
但如果接种到不同的菌株中，如λK在B株
上接种效率只有10-4，而不管λK还是λB在C株
上的接种效率都为1。



原来，E.coli K株和B株都各自含有一种限制修 饰系统，其限制性内切酶能将外来DNA切断。 ——限制 每一种内切酶在DNA上都有一定的结合位点。 菌株本身的DNA也含有这样的结合位点时，该 菌株的甲基化酶就在这些识别位点上将腺嘌呤甲 基化(成为N6—甲基腺嘌呤)；或者将胞嘧啶甲基 化(成为5—甲基胞嘧啶)。这样限制性内切酶就 不会将自身的DNA降解掉。 ——修饰 这两方面作用结合起来，就称为限制—修饰作用。

由于两条链上的切口位置不同。可以有粘性末端
(sticky ends或cohesive ends)和平齐末端(blunt ends 或flush ends)。粘性末端可以是5'突出粘性末端， 也可以是3'突出。 大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上， 因而具有严格的底物特异性，识别的是对称序列 一般为4bp-6bp的回文序列,但有极少的酶作为单 聚体结合到DNA上,识别非对称序列。 也有少数酶能作用于与相应的单链序列，但是， 这种作用比对双链识别位点的作用慢得多。拿研 究较多的Ⅱ类限制酶HaeⅢ来说，两种作用速度 相差16倍。
I saw alba able was I
EcoR I
Hind III Hpa II/Msp I
Sal I
BamH I
Smal I
G/AATTC A/AGCTT C/CGG G/TCGAC G/GATCC CCC/GGG
Restriction enzymes can cut the DNA such that they leave a 5' overhang (BamHI), a 3' overhand (PvuI), or a blunt end with no overhang (DpnI).
新寄主的修饰标记而缺少祖代 寄主的修饰标记，只能感染新
的寄主类型，而不再能感染祖
代寄主。
这里所谓自我DNA和外源DNA是对于它的
限制—修饰模式而言, 凡限制—修饰模式相 同的DNA均为自我DNA，这包括同株系不 同个体的DNA，及寄生于这些菌株中的质 粒和噬菌体。 在同一个细胞内的不同类型的DNA，包括 细胞DNA，质粒DNA，噬菌体DNA等，都 具有同样限制—修饰模式。这些同一细胞 中的不同DNA可统称为该细胞中的居民 DNA(resident DNA)。
一、限制性内切酶分类
传统上将限制性内切酶划分为三大类 type I、typeⅢ：它们的限制酶和甲基化酶 都作为亚基包含在同一个酶分子中。 typeⅡ：它与相应的甲基化酶是分开的；不 属同一个酶分子。在重组DNA技术和生化分析技 术中所常用的限制性内切酶均为二类限制酶。
I 型限制性内切酶
是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性 的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点 很远的地方任意切割DNA链。
一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别 GAATTC）；而另一些识别不连续的序列 （如Bgl I识别GCCNNNNNGGC）。限制性 内切酶的切割后产生一个3'羟基端和一个5'磷 酸基团。它们的活性要求镁离子，而相应的 修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶 一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基 酸左右。
限制性酶的命名：根据分离出此酶的微生物
学名而定。取微生物属名的第一个字母和种 名的头两个字母组成三个斜体字母，遇有株 名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几
个不同的酶，则用罗马数字加以表示。例如
大肠杆菌的Eco RI，R表示株名，I表示该菌
中第一个被分离出来的酶。
已纯化分类3000种限制性内切酶；
已发现了超过250种的特异识别序列。
限制性内切酶的主要功能是保护细菌
不受噬菌体的感染。
当一个没有限制性内切酶的细菌被病
毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功 地进行感染。然而一个有限制性内切 酶的同种细菌被成功感染的比率显著 下降。 出现更多的限制性内切酶将会起到多 重保护作用；而一个拥有4到5种各自 独立的限制性内切酶将会使细胞坚不 可摧。
同尾酶(isocaudomers) 有些来源不同的
限制酶，识别及切割序列各不相同，但 却能产出相同的粘性末端，这类限制酶 称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的 DNA片段经连接后所形成的重组序列， 不能被原来的限制酶所识别和切割。 EcoRI和MunI属于同尾酶。
同裂酶或同位酶(isoschizomers) 有些
限制酶的底物，又可作甲基化酶的底物；但在体内
可能主要被限制(即被限制酶切断)。
在居民DNA上，都是全甲基化的。随 着DNA的复制，产生的子代DNA都是 半甲基化的；但是不久，在复制过 程中和复制结束后的短时间内就完 成了全甲基化过程。而外源DNA的命 运绝大多数是被限制，只有极少数 能躲过限制作用而被修饰。
III型限制性内切酶
也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们 在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别 位点是反向重复序列；它们很少能产生完全 切割的片段，因而不具备实用价值，也没有 人将其商业化。
二、II型限制性内切酶
切割位点就在识别位点内或其附近,是用于DNA 分析和克隆的一类。 限制酶和甲基化酶是各自独立的两个酶,例如 EcoRI的限制酶是相同亚基的二聚体，而其相 应的甲基化酶为一单肽链。