EP6.0色谱分离技术(中文)

EP6色谱分离技术
色谱分离技术是多级分离方法，样品组分要分配到两相中，一种是固定相，一种是流动相。

固定相可能是一种固体或者是固体上支持的液体或凝胶。

固定相可以填充到柱中，或涂布为一层，或分散为一个薄膜等。

流动相可能是气态或液体或超临界流体。

分离原理可能是基于吸收、质量分布、离子交换等，或可能基于分子的理化性质不同，如粒度、质量、体积等。

本章包括系统适应性一般参数的定义和计算，以及一般适用性要求。

在下列章节给出了分离原理、仪器和方法：
--纸层析（2.2.26）
--TLC色谱法（2.2.27）
--气相色谱法（2.2.28）
--液相色谱法（2.2.29）
--分子排阻色谱法（2.2.30）
--超临界流体色谱法（2.2.45）
定义
下列定义用于计算专论中的限度。

对于某些设备，某些参数（如信噪比）可以用生产商提供的软件计算。

用户有责任确保软件中的计算方法与欧洲药典的要求相一致。

如果不同，必需进行校正。

色谱图
一张色谱图是检测器响应值、流出浓度或其他数量的绘图的或其他标示，作为流出浓度、时间、体积或距离的一种测量。

理想的色谱图是基线上出现高斯峰。

保留数据
保留时间和保留体积
洗脱色谱法中的保留测量可能是保留时间（t R），由色谱图中最大峰的位置直接进行定义。

保留体积(V R)可以通过保留时间来计算：
V R=v×t R
t R=保留时间或沿基线从进针处到相应组分的最大峰垂直处之间的距离。

v=流动相的速率。

质量分布比率
质量分布比率（Dm）（也称为容量因子k’或保留因子k）规定如下：
固定相中溶质数量Vs
Dm==Kc
流动相中溶质数量V M
Kc=平衡分布系数（也称为分布常数）
Vs=固定相体积
V M=流动相体积
一个组分的质量分布比率可以使用下列公式从色谱图中测定：
t R-t M
Dm=
t M
t R=保留时间（或体积）或沿基线从进针处到相应组分的最大峰垂直处之间的距离。

t M=保持时间（或体积）：时间（或体积）或沿基线从进针处到一个未保留组分的最大峰垂直处之间的距离。

分布系数
在分子排阻色谱法中，一个特定柱子中的一个组分的洗脱性质可以通过分布系数（Ko）表示，计算公式如下：
t R-t o
Ko=
t t-t o
t R=保留时间（或体积）或沿基线从进针处到相应组分的最大峰垂直处之间的距离。

t o=保持时间（或体积）：时间（或体积）或沿基线从进针处到一个未保留组分的最大峰垂直处之间的距离。

t t=保留时间（或体积）或沿基线从进针处到相应的一个组分的最大峰垂直处之间的距离，这个组分可以全部通过固定相的小孔。

延迟因子
在平面色谱法中，延迟因子（R F）（也称为保留因子R f）是从原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。

b
R F=
a
b=分析物的移动距离
a=溶剂前沿的移动距离。

色谱数据
峰可以用峰面积（A）、或峰高（h）和半峰高的峰宽（w h）、或峰高和变形点之间的峰宽（w i）来定义。

在高斯峰（图2.2.46.-1）中有如下关系：
w h=1.18w i
图2.2.46.-1
对称因子
一个峰的对称因子（As）（或拖尾因子）（图2.2.46.-2）计算如下：
w0.05
As=
2d
w0.05=在峰高的二十分之一处的峰宽，
d=最高峰的垂直处与二十分之一峰高处的的前边沿处之间的距离。

值1.0表示完全（理想）对称。

图2.2.46.-2
柱性能和理论板数
柱性能（表观效率）可以由在等温线、等度或等密度曲线的条件下获得的数据计算。

理论板数（N）用下列公式表示，t R和w h必须用相同单位（时间、体积或距离）表
示。

N=5.54(t R/w h)2
t R=保留时间（或体积）或沿基线从进针处到相应组分的最高峰垂直处之间的距离。

w h=半峰高处峰宽。

理论板数随组分、色谱柱和保留时间而变化。

分离数据
分离度（Rs）
用下面的公式计算两组分峰之间的分离度（Rs）：
1.18（t R2-t R1）
Rs=
w h1+w h2
t R2>t R1
t R2和t R1=保留时间或沿基线从进针处到两个相邻峰的最高峰垂直处之间的距离。

w h1和w h2=半峰高处峰宽。

对应于基线分离的分离度应大于1.5.
如果峰之间不是基线分离，则上述公式不适用。

在定量平面色谱法中，使用移动距离代替保留时间。

分离度可用下式计算：
1.18a(R F2-R F1)
Rs=
w h1+w h2
R F2和R F1是原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值（延迟因子）。

w h1和w h2是半峰高处的峰宽
a是溶剂前沿移动的距离。

峰谷比
在其它甾体检测中，当两峰之间的基线分离没有达到要求时，峰谷比（p/v）可以作为系统适用性的一个要求（图2.2.46.-3）。

p/v=Hp/Hv
Hp是较小峰的外推基线上的峰高；
Hv是两峰之间曲线的最低点与外推基线之间的高度。

相对保留时间
相对保留时间
相对保留时间（r）是由下式计算的：
t R2-t M
r=
t R1-t M
t R2是计算峰的保留时间
t R1是对照峰的保留时间（通常是样品峰）
t M是保持时间：沿基线从进针处到相应一个未保留成分最高峰垂直处之间的时间或距离。

未调整的相对保留时间（r G）是由下式计算的：
t R2
r G=
t R1
除非另有规定，专论中所指的相对保留时间是未调整的相对保留时间。

在平面色谱法中，使用延迟因子R F2和R F1代替保留时间t R2和t R1.
定量的精确性
信噪比
信噪比（S/N）影响定量的精确性，由下式计算：
S/N=2H/h
H是图2.2.46.-4中对照溶液色谱图中相关成分对应峰的峰高，从最高峰到垂直的信号基线。

h是空白进样后色谱图中背景噪音的范围，
重复性
响应值的重复性是用标准溶液的连续系列进样或点板的相对标准偏差的百分数来表示，用下面的公式表示：
y i是内标法中用峰面积、峰高、或峰面积比率表示的单个值；
y是单个值的平均值；
n是单个值的数量。

最大允许的相对标准偏差（RSDmax）由一系列规定限度的对照溶液进行计算，公式如下：
K是常数（0.349），从公式得到，0.6/√2表示B=1.0时6次进样要求的相对标准偏差。

B是在专论中规定的上限减去100%。

n是对照液重复进样次数（3≤n≤6）。

T90%，n-1是带有n-1个自由度的90%的概率水平的t分布（也叫学生分布）。

系统适应性
系统适应性检测代表方法的一个完整部分，用以确保色谱系统足够的性能。

表观效率、质量分布比率、分离度、相对保留时间和对称因子是评估色谱柱性能的参数。

可能影响色谱行为的因素包括组成、离子强度、流动相的温度和表观pH、流速、柱长、温度和压力、以及包括多孔性、粒度、粒子类型、比表面积、在反相情况下的化学改性的程度（用封端、炭载等表示）在内的固定相特性。

不同的样品在仪器上使用，必须进行确认，能够达到检验所要求的精度。

除非在专论中另有规定，否则下列要求必需完全满足。

--主峰的对称因子应在0.8和1.5之间，除非在专论中另有规定。

一般情况下，这要求适用于专论中的检测和含量测定。

--标准溶液重复进样最大允许的相对标准偏差不超过表2.2.46.-1的值。

这要求只适用于含量测定，不适用于其它甾体的检测。

--峰的检测限（对应于一个信噪比3）应低于其它甾体检测的忽略限度。

--峰的定量限（对应于一个信噪比10）应等于或小于其它甾体检测的忽略限度。

表2.2.46.-1重复性要求
进样次数3456
B%最大允许的相对标准偏差
2.00.410.590.730.85
2.50.520.740.92 1.06
3.00.620.89 1.10 1.27
色谱条件的调整
色谱检验中不同参数可以被调整以满足系统适应性标准，但不能根本地修改方法，调整限度列在下面的信息中。

专论建立的时候已经验证过色谱条件。

其中包含了系统适应性检测，以确保检测或含量测定时能达到要求的满意性性能的分离。

但是，一般情况下，固定相是规定的，商业上的产品有很多变化，伴随着色谱行为的不同，色谱条件可能需要做一些调整以达到规定的系统适应性要求。

尤其在反相液相色谱方法中，多个参数的调整不一定导致满意的色谱结果。

在这种情况下，有必要用相同型号的色谱柱取代这个柱子（例如ODS硅胶柱），以显示要求的色谱行为。

对于关键参数，专论中清楚的规定了调整，以确保系统适应性。

多个调整对系统性能造成的累加效果应避免。

TLC和纸色谱
流动相的组成：较小溶剂成分的总量可以调整相对±30%或绝对±2%，选用更大的一个；对于在流动相中10%的较小组分，相对±30%的调整允许一个范围是7-13%，而一个绝对±2%的调整允许一个范围是8-12%，所以相对值更大；对于在流动相中5%的较小组分，相对±30%的调整允许一个范围是3.5-6.5%，而一个绝对±2%的调整允许一个范围是3-7%，所以在这种情况下绝对值更大。

其他成分允许调整绝对
±10%。

流动相水成分的pH：±0.2pH，除非专论中另有规定，或者±1.0pH，当样品是中性物质时。

流动相中缓冲成份的盐浓度：±10%。

点样量：规定量的10-20%，如果使用精细粒度板（2-10um）。

在高性能板上，溶剂前沿移动距离不能低于50mm或30mm
液相色谱法
流动相的组成：较小溶剂成分的总量可以调整相对±30%或绝对±2%，选用更大的一个（见上面例子）。

其他成分允许调整绝对±10%。

流动相水成分的pH：±0.2pH，除非专论中另有规定，或者±1.0pH，当样品是中性物质时。

流动相中缓冲成份的盐浓度：±10%。

检测器波长：不允许调整。

固定相：
--柱长：±70%
--柱内径：±25%
--粒径：最大减少50%，不允许增加。

流速：±50%。

如果在专论中主峰的保留时间已规定，色谱柱内径改变，则流速必须调整。

在确认阶段，如果专论中使用理论板数，则不允许减低流速。

温度：±10%，最大60℃.
进样体积：如果样品峰的检测和重复性达到满足，可以减少。

梯度洗脱：仪器的结构可能会明显地改变检测方法中规定的分离度、保留时间、相对保留时间。

如果这种情况发生，可能是负载体积过多。

气相色谱法
固定相：
--柱长：±70%
--柱内径：±50%
--粒径：最大减少50%，不允许增加。

--涂膜厚度：-50%至100%
流速：±50%。

温度：±10%。

进样体积：如果样品峰的检测和重复性达到满足，可以减少。

超临界流体色谱法
流动相的组成：对于填充柱：较小溶剂成分的总量可以调整相对±30%或绝对±2%，选用更大的一个。

毛细管柱系统不允许调整。

检测器波长：不允许调整。

固定相：
--柱长：±70%
--柱内径：±25%（填充柱）；±50%（毛细管柱）
--粒径：最大减少50%，不允许增加（填充柱）。

流速：±50%。

温度：±10%.
进样体积：如果样品峰的检测和重复性达到满足，可以减少。

定量
--检测器响应值：检测器灵敏性是信号输出除以进入检测器的流动相中的物质的单位浓度或单位质量。

检测器相对响应因子，一般用响应因子作参照，表示检测器相对于一个标准物质的灵敏性。

修正因子与响应值因子成反比。

--外标法：被测试成分的浓度可以通过对比样品液中响应值（峰）和对照液中响应值（峰）获得。

--内标法：被测成分的总量可以通过内标物加入样品液和对照液进行计算。

内标物不应与被测物发生反应；内标物必需稳定，并且不含与被测物保留时间相似的杂质。

被测物的浓度可以这样计算：对比样品液中被测物和内标物的峰面积比率或峰高比率与对照液中被测物和内标物的峰面积比率或峰高比率。

--归一化法：被测物中一个或多个成分的百分含量是由这个峰面积与所有峰的峰面积总和的百分比计算的，峰面积总和不包括溶剂峰、试剂峰和忽略限度下的峰。

--校验程序：被测量或被评估的信号（y）和物质（x）总量（浓度、质量等）的关系需要检测，校验功能被计算。

依靠反函数，由测量到的被分析物信号或评估的被分析物信号计算分析结果。

对于成分的含量和定量检测，外标法、内标法或校验程序在专论中可能都有描述，一般不采用归一化法。

在其他甾体的检测中，一般采用外标法或归一化法。

然而使用归一化法或外标法时，当样品液稀释用于对照时，其他甾体的响应值与自身是相似的（响应因子0.8至1.0），否则，文中应有修正因子。

当其他甾体检测中规定了杂质总量或单个杂质的定量检测时，选择一个合适阈值设定和合适的峰面积积分条件是非常重要的。

在这种检测中，忽略限度（如低于不被考虑进行计算的限度的峰面积）一般是0.05%。

因此，数据收集系统的阈值设定应至少是忽略限度的一半。

当杂质峰与主峰未完全分离时，这个杂质峰面积积分时更适宜用峰谷对峰谷的方法。

溶解样品的溶剂峰也可以忽略。