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扫描电镜标本制备技术[资料]
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扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。
透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。
由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。
一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。
2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。
3.导电性能要好，应进行导电处理。
4.二次电子的发射率要高。
5.注意确认和保护样品的观察面。
尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。
(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。
2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。
3.取材部位要准确。
观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。
观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。
为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。
4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。
5.操作应在低温(0～4℃)下进行。
(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。
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谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
扫描电镜及其制样技术
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、ห้องสมุดไป่ตู้信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
扫描电镜样品制备
3、清洗：对于一些表面凹凸不平较厉害，且粘有许
多杂质的样品，在固定的前后都要进行彻底的清洗，以 免影响成像的质量。
三种清洗方法——
(1)蛋白酶消化法：这种方法比较简便，适用于易清洗的 样品，步骤如下：
(3)如果图像的质量不行，可以改用导电胶粘样品和适当喷 涂。
2、活体样品的直接观察法：对于一些体积较小，且含
水分少的活的昆虫类等样品，如：蚊、螟、蚁、蛾等，也 可以省略化学固定等一系列步骤，使之在生活状态下就可 用扫描电镜观察。具体步骤如下：
(1)取样：不要碰伤样品。 (2)清洗：用生理盐水或PBS洗1—3次(不要致死样品、清
高锰酸钾后固定 脱水：丙酮，叔丁醇、乙腈 干燥：自然干燥、真空干燥、液体CO2临界点干燥
法、冷冻干燥法 样品的导电处理：金属镀膜法（真AgNO3、 醋酸铀、柠檬酸铅、重铬酸钾样品表面离子化 或产生导电性金属化合物）
1、临界点干燥
(一)临界点干燥仪的结构——
临界点干燥(Critical Point Drying，CPD)是当前最 常用的一种方法。(图)
有多种临界点干燥仪，如：Anderson制作的和田中敬 一制作的旧式临界点干燥仪；较新型的日本电子HCP一4、 Bomar SPC、Parr 4770；以及日立HCP—l、HCP一2临界点 干燥仪等。(图),
不同的物质有各自的临界点、临界压力和临界密度。物
理实验证明，某物质在其气液面消失的状态下，表面 张力作用消失，分子之间的内聚力等于零。
临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。
2 ．选择干燥剂：
考虑到生物样品有限的承受力，一般要选择低温和低 压临界点的干燥剂。
扫描电镜样品的制备课件PPT教学
取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
清洗
➢ 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接近样品材料的生理值， 以免样品因环境突变而产生形变。
固定
➢ 选择方法：
脱水 ✓植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
✓动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
干燥
✓游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物)；
粘样
（5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。 样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率
镀膜 （6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、 组织液凝聚而影响观察效果。
镜检
通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力
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取材 三、固定方法
清洗 固定
1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
8000离心 2~5分钟
霉菌
切割菌落
戊二醛固定
常规固定 脱水干燥 粘样镀膜
常规脱水干燥
杆菌10μm
球菌10 μm 酵母菌5 μm
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曲霉20 μm
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第二节 特殊要求的扫描制样技术
——组织细胞的内部结构观察法
简易剖出法
切断法：多孔组织 掰开法：实质性组织 拉断法：纤维组织
（1）植物材料：根部水冲洗去泥土，地上部用水冲洗或滴洗。 观察气孔状态时应注意清洗后取材时机。
（2）较干净的样品：固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次。
脱水 干燥
（3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。 （4）游离细胞、微生物：离心法清洗。
清洗液与样品混合摇匀 低速离心（反复三次）
扫描电镜生物样品制备技术PPT课件
材 料 学 土 聚 水 泥
制备扫描电镜样品的总要求
在不损伤样品原始结构状态 的情况下，保证样品的体积和表 面积不发生改变，充分暴露样品 表面的微细结构 。
生物样品的特性
含水量高 质地柔软 导电性差 二次电子产率低 对热、电子束等敏感
扫描电镜生物样品要求：
不含水份 具有较高的二次电子发射率 良好的导电性 耐热性 最大限度的保持样品的形貌
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
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谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
C
SEM觀察泡桐根瘤線蟲微細構造
SEM觀察A. scrobiculata 孢子之外觀形態 (橫線=60mm)
SEM觀察G. mosseae
丛枝菌根真菌
孢子之外觀形態 (橫線=100mm)
未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造 (A：橫線=300mm；B：橫線=12mm)
接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造 (A：橫線=30mm；B：橫線=12mm)
T R
R T
T. harzianum (T)寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形
松材線蟲(雄)
松材線蟲(雌)
松材線蟲頭部口針
白粉病分生孢子 麻竹墊銹菌孢子
第二节 扫描电镜特殊样品制备技术
特殊生物样品制备主要有： （1）管道铸型样品 （2）冷冻断裂样品 （3）游离细胞样品 （4）组织消化样品
1. 管道铸型样品
心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的semsem心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的featuressemfeaturessem心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的featuressemfeaturessem心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的featuressemfeaturessem心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的featuressemfeaturessem生物医学动物材料化学物理地质冶金矿物污泥杆菌机械电机及导电性样品如半导体电子材料等心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的1010心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的目的
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
扫描电子显微镜的样品制备技术PPT课件
氟利昂13 28.9
临界压力（kg/cm2） 71.2
38.2
标准大气压下
氟利昂23 25.9 47.7
液态二氧化 碳、
31.1
72.8
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临界点干燥法原理
• 在干燥过程中，表面张力会使样品变形。因此，为了保持 样品的完好形态，必须消除表面张力造成的影响。我们知 道，液体表面张力随其温度的升高而急骤变小。对于每一 种液体，都有一个表面张力为零的温度，这个温度叫临界 温度。与临界温度对应的压力叫临界压力，在临界温度和 临界压力下使样品干燥的方法叫临界点干燥法。现在，国 内外都有商品临界点干燥仪。
• 脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和
防止样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。
采用不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中
的水分。
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6.2.2 样品的干 燥：
• 1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于 表面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、 牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材 料如细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到 100％，在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要 干燥。因为脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水 剂中不会过多变形而影响其结构。
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6.1.3粉体试样的制 备
• 粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上， 用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用 洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒。
• 对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时， 将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散， 再用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上， 待液体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附 力即可粘附在样品座上。
扫描电镜的样品制备
扫描电镜的样品制备3.1 试样制备技术试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。
如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果。
和透射电镜相比，扫描电镜试样制备比较简单。
在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。
扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。
但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件，只简单地引用已有的制样方法是不够的。
扫描电镜的特点是：①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。
②试样应具有良好的导电性能，不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。
③试样表面一般起伏（凹凸）较大。
④观察方式不同，制样方法有明显区别。
⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。
上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件。
在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和照相。
3.1.1 块状试样制备1．导电性材料导电性材料主要是指金属，一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。
这类材料的试样制备最为简单。
只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm，最厚不超过20mm等），然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好），等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。
但在制备试样过程中，还应注意：①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。
②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。
扫描电镜制样技术
• 锇酸浸透性慢不强，较长时间处理，会 破坏生物样品精细结构。需根据样品情 况，灵活掌握锇酸处理样品时间。
直接观察法
直接观察法
• 特点：简便、快捷，损伤较少，比较常
用。
• 1．固体样品直接观察法：含水成
分少，本身比较干燥且又有一定的导电 能力的固体样品。 • 如：骨骼、牙齿、矿石、土壤、干果、 竹木以及植物的干标本等。 • 直接用普通胶水或双面胶带等将样品粘 到样品台上，省略喷涂就可用扫描电镜 观察。
离子溅射法和真空喷镀法比较
附：导电染色
• 导电染色------将极细的金属颗粒植入生 物样品中，以增强样品导电性的电子染 色过程。
• 要求：染液既不污染组织、又能完好保存组 织的精细结构，并且使样品有良好的导电性。 • 特点：经导电染色样品，释放较多的二次电 子，加强图像的亮度和反差。 • 常用导电染液：缓冲液／固定液配制而成， 同时具有固定作用。
3．注入液体二氧化碳困难：
• 样品室温度高，没有事先降温。 • 降温办法： • 一是用少许液体二氧化碳充盈2—3 次，再放掉气化的二氧化碳； • 二是用控温钮调至低于当时室温 10℃。
冷冻干燥
• 样品中的水分直接由冰态升华为气态，样 品也不受表面张力的影响。 优点：保存水溶性和脂溶性物质。 不足：样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构。
游离细胞的观察法
• 关键：如何把样品粘在样品台？
• 1．滤纸吸附法： • 用1％戊二醛／缓冲液固定---1 000g 10min离心---去上清---细胞浓悬液滴在 一小片滤纸上---系列乙醇脱水---临界 点干燥---喷涂----观察。 • 优缺点：简便易行，图像中容易混杂 滤纸纤维。
2．金属片法 • 与第一种方法类似； • 只是将细胞浓悬液滴在有微孔的金属 片上(微孔直径4 µm)； • 进行一系列操作。 • 优点：可以减少污染