HXY-第一章-基因工程概述
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《基因工程的概述》word版
第一章基因工程第一节基因工程的概述【学习目标】1、简述基因工程的概念含义，简述基因工程的诞生历程，认同基因工程的诞生和发展离不开理论突破和技术创新2、简述基因工程的原理，说出DNA重组技术的基本工具及其作用、特点，简述基因工程基本操作程序，以及各步骤的一般方法、原理，模拟重组DNA分子的操作过程【课前预习】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，在通过人工和等方法，对生物的基因进行和，然后导入并使重组基因在中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
因而又叫DNA重组技术。
基因工程是在水平上操作、改变生物遗传性状的技术，包括基因的、以及在受体细胞内的和过程。
2、为基因工程的创立作出了重要的理论铺垫，而的发现，则直接促进了基因工程的诞生。
1973年，美国科学家将不同来源的两种DNA分子体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达。
3、“分子手术刀”：。
其作用的特点是：其产生的DNA末端有两种形式：和。
“分子针线”将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的。
4、“运载工具”。
通常利用质粒作为载体。
作为载体必须具备以下条件：载体DNA必需有一个或多个的切割位点；载体DNA必需能在受体细胞中；载体DNA必需带有特殊的基因。
5、基因工程的基本操作步骤包括：①②、③、④6、PCR是一项在生物复制特定DNA片段的核酸合成技术。
目的基因受热形成，与结合，在的作用下延伸形成DNA。
【共同探究】【思考题1】（10全国2）下列叙述符合基因工程概念的是A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上（一）DNA重组技术的基本工具1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
第一章 基因工程概述
2. 1 基因是基因重组的物质基础
基因作为独特的独立单位 而代代相传。细胞中有成对的 基本遗传单位，在杂种的生殖 细胞中，成对的遗传单位一个 来自雄性亲本，一个来自雌性 亲本，形成配子时这些遗传单 位彼此分离。
孟德尔
1909年，丹麦生物学家约翰逊 （Wilhelm Ludwig Johannsen， 1857～1927）根据希腊文“给 予生命”之义，创造了基因 （gene）一词，并用这个术语代 替孟德尔的“遗传因子”。不过 他所说的基因并不代表物质实体， 而是一种与细胞的任何可见形态 结构毫无关系的抽象单位。因此， 那时所指的基因只是遗传性状的 符号，还没有具体涉及基因的物 质概念。
5、老鼠库姆利纳
5、老鼠库姆利纳2000年，科学家在美国 夏威夷成功克隆一只老鼠，这只老鼠被命 名为“库姆利纳”（Cumulina），它一直 存活了两年7个月。据悉，这在克隆研究领 域是一项重大突破。
6、母牛诺托和卡加
这两头母牛是在1998年被成功克隆的，随 后克隆了数千头母牛，这是日本克隆技术 上的最大成果，这项技术也为其他克隆技 术生产出更好的肉质和牛奶做出巨大贡献。
9、野牛诺亚
2001年，一只叫做诺亚的亚洲野牛被成功 克隆，据悉，近年来亚洲野牛的数量锐减。 诺亚由于痢疾只存活了两天。
10、克隆猫科毕
这只名叫科毕的猫于2001年成功克隆，从 此开辟了宠物克隆市场，并最终形ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ了克 隆宠物的国际性行业。
中国完成世界首例转基因克隆兔实验
家兔的克隆是一个世界性难题 。由于兔子和人在 生理上较为接近,克隆兔的出现,可将其作为帮助人 类筛选药物、研究遗传学疾病的“动物模型”,有 助于研究一些人类遗传疾病。
“我们4月2日拿到最后一份检测报告。”马天杰说，5个 被检出含转基因成分的产品不仅包括此前披露的保质期至 2007年3月12日（K/A）的批次，而且还涉及保质期至 2007年5月13日（E/A）等批次的亨氏米粉产品，其中3个 产品被进一步证实含有未经批准的转Bt基因水稻。
第一章 基因工程
互补显色筛选法：蓝白斑筛选
５－溴－４－ 氯－３－吲哚 －β－Ｄ－半 乳糖苷
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当 外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，α-互补被破坏，使得 带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
限制性酶切割
已获目的基因大致种类：与医药相关的基 因；抗病、虫害和恶劣环境的基因；编码特殊 营养价值的蛋白或多肽基因。
㈠目的基因的获取
◆化学合成法：利用DNA合成仪合成一些较小 的链反应（PCR）
1、化学法合成（已知目的基因序列）
如果外源DNA 插入，氨卞青霉素 抗性基因失活
如果外源DNA插 入，四环素抗性基 因失活
pBR322质粒结构
互补显色筛选法：蓝白斑筛选
β-半乳糖苷酶基因的 调控序列和前146个氨 基酸的编码信息 插入的一个多克隆位点
这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞
宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有 酶学活性的蛋白质，称为α-互补。
限制片段
琼脂糖电泳
DNA分子
Southern 印迹法
带有DNA片 段的凝胶
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜 与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
基因芯片
5´ CTGACTTCGACAAAGAA
3´未知序列的单链DNA 放射性标记的引物
“水稻基因组计划”：中国水稻（籼稻）基因组 “工作框架图”和数据库已完成。 中、英两国合作 “家猪基因组计划”。
㈢ 目的基因与载体结合（形成重组DNA分子 ）
基因工程概述
别怕，这都 是假想的图 片
第一章 基因工程
第一节 基因工程概述
•主要内容：
（1）基因工程的概念 （2）基因操作的工具 （3）基因操作的基本步骤
一、 基因工程的概念 这种技术是在生物体外，通过对 DNA分子进行人工“剪切” 和“拼接”，对生物的基因进行 改造和重新组合，然后导入受体 细胞内进行无性繁殖，使重组基 因在受体细胞内表达，产生出人 类所需要的基因产物。
三、将目的基因导入受体细胞
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农 • 常用的受体细胞： 杆菌、酵母菌和动植物细胞等
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
1、将目的基因导入植物细胞
特点: （1）农杆菌 转化法
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起 始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对 mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因 从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同 而有所差别
3、基因的运输工具——运载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细 胞内去！能将目的基因送入细胞的工具就是运载体。 运载体必须同时满足 三个要求： ①具有多个限制酶切点； ②能进入受体生物细胞并 在受体生物细胞内复制并 表达； 目 ③具有标记基因。 的 基 常用的载体有质粒、 因 插 噬菌体、动植物病毒等； 入 最早用的载体是一种环状 位 点 DNA——质粒。
第一章 基因工程
第一节 基因工程概述
•主要内容：
（1）基因工程的概念 （2）基因操作的工具 （3）基因操作的基本步骤
一、 基因工程的概念 这种技术是在生物体外，通过对 DNA分子进行人工“剪切” 和“拼接”，对生物的基因进行 改造和重新组合，然后导入受体 细胞内进行无性繁殖，使重组基 因在受体细胞内表达，产生出人 类所需要的基因产物。
三、将目的基因导入受体细胞
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农 • 常用的受体细胞： 杆菌、酵母菌和动植物细胞等
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
1、将目的基因导入植物细胞
特点: （1）农杆菌 转化法
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起 始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对 mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因 从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同 而有所差别
3、基因的运输工具——运载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细 胞内去！能将目的基因送入细胞的工具就是运载体。 运载体必须同时满足 三个要求： ①具有多个限制酶切点； ②能进入受体生物细胞并 在受体生物细胞内复制并 表达； 目 ③具有标记基因。 的 基 常用的载体有质粒、 因 插 噬菌体、动植物病毒等； 入 最早用的载体是一种环状 位 点 DNA——质粒。
第一章基因工程概述
理论上的三大发现和技术上的三大发明
对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。
1、DNA是遗传物质被证实
1944年，Avery O.T.利用肺炎双克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发 表了改进的肺炎双球菌实验结果。 （1） S型菌细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型 菌转变成S型菌； （2）经DNase 处理的S型菌细胞提取物失去了转化 作用。 （3）经胰蛋白酶处理的S型菌细胞提取物仍有转化作 用。 不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以 将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是 现代生物科学的革命性开端。
• 生物技术通报 • 中国生物工程杂志 • 农业生物技术学报 • 生物工程学报 • 生物技术 • 遗传
• Molecular genetics and genomics • Animal biotechnology • Nature genetics • Plant cell • Science • Nature
美国国立卫生研 究院给一名患有 先天性重度联合 免疫缺陷病的4岁 女孩实施了首例 基因治疗。这种 疾病因腺苷脱氨 酶（ADA）基因 变异引起。
基因治疗
c、转基因植物
转 基 因 植 物
抗除草剂的水稻
d、 转基 因动 物和 器官 移植
器官移植
器官再造
艾妮莎．艾亚拉（Anissa Ayala）的故事： 1988年的春天，艾妮莎还是一名高二的学生时，突 然患了骨髓淋巴癌。要彻底治疗，必须彻底清除其 原有的骨髓干细胞，换以新的相容的骨髓细胞。艾 妮莎的父母四处奔走，搜寻骨髓捐赠者，但两年的 努力均告失败。艾妮莎的45岁的父亲与42岁的母亲 决心与命运一博，再度怀孕，于1990年4月生下了 艾妮莎的妹妹玛瑞莎。14个月以后，妹妹与姐姐做 了骨髓移植手术，艾妮莎终于健康地活下来了。
第一章+基因工程概述
转 基 因 植 物
抗除草剂的水稻
3.基因工程在医药领域的应用
1. 遗传性疾病： 肿瘤、心脑血管病、糖尿病、过度肥胖综合症、老 年痴呆症、骨质疏松症等 2. 抗衰老：端粒酶编码基因 动物疾病模型的建立 基因诊断 基因治疗 器官移植
基 因 治 疗
器官移植
三 、基因工程与其他课程的关系
1997年3月11日，马来西亚政府反对任何企图克隆 人类的尝试；世界卫生组织总干事中岛宏宣称反 对克隆人的研究；欧盟委员会声明反对克隆人。 美国总统克林顿在维尔穆特克隆羊出现后，召集 一群科学家，限他们在90天之内就该不该让“克 隆人”成为可能给出一个答案； 法国总统密特朗在听到杰里．豪关于人体胚胎复 制的消息时曾打电话说：“这个消息令人毛骨悚 然。”
第一 个转 化成 功 的重 组 DNA 分子
3. 基因工程的发展
基因工程的发展： 1. 1972-1976年，日本人，somatostatin(抑促生长素)； 2. 1978年，美国人，生长激素基因（HGH）； 3. 1980年，美国/瑞士人，a干扰素－基因； 4. 1984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）； 基因工程的腾飞： 1. 1982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠； 2. 1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌Neor基因） 3. 1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫 缺陷症（SDID） 4. 1991年，美国倡导，人类基因组计划109bp，15年时间30亿USD； 5. 1997年，美国人，威尔穆特克隆多利绵羊和转基因波莉绵羊
一波未平，一波又起。1998年1月6日，美 国科学家里查德堂而皇之地在美国《科学》 杂志上公开声明，准备进行克隆人的研究！ 比尔．盖茨说：“当然应该克隆人。如果 谁第一个掌握了这个技术，他就是我真正 的、也是唯一的竞争对手。” 英国和俄罗斯也不反对克隆人。
基因工程知识点全
第一章第二章第三章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。
从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。
1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第四章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
具有合适的筛选标记。
分子量小，拷贝数多。
具有安全性。
2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建（1）删除不必要的DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA 片段的装载量。
一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。
（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
第一章 基因工程概述
二十世纪50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则” 和操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明了 信息的流向和表达问题。
DNA分子的双螺旋模型
中 心 法 则
Rev 1 DNA 聚合酶
DNA
复制
2.1 基因工程的准备阶段 技术基础
20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA 连接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割 和连接成为可能。 70年代中期，DNA分子的核苷酸 QQ: 185484577
Email: 185484577 @
课程目的
要求掌握 基因操作中基本的普遍应用的原理 并能自主设计通用操作方法和策略
基本要求：
掌握基因克隆的基本工具。特别是不同的载体。 克隆基因的基本方法。 怎样利用基因重组技术研究基因的结构、表达和调控。 能够设计一个基因克隆的程序 PCR技术基本原理和应用 能够根据酶切结果判读酶切图谱，以及判读DNA序列的 能力。 利用基因工程生产重组蛋白，基因工程在医药和农业上 的应用。
2.3 基因工程的迅速发展阶段 2.4 基因工程发展过程中的重大事件
2.1 基因工程的准备阶段 理论基础
二十世纪40年代，确定了遗传信息的携带者，即基因 的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的 物质基础问题。
二十世纪50年代，揭示了DNA分子的双螺旋模型和半保 留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。
（用DNA末端转移酶，而非 限制性内切酶）
1980年Nobel化学奖
2. Boyer-Cohen实验
1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡 那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环 素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成 重组质粒，具有双重抗药性。
DNA分子的双螺旋模型
中 心 法 则
Rev 1 DNA 聚合酶
DNA
复制
2.1 基因工程的准备阶段 技术基础
20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA 连接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割 和连接成为可能。 70年代中期，DNA分子的核苷酸 QQ: 185484577
Email: 185484577 @
课程目的
要求掌握 基因操作中基本的普遍应用的原理 并能自主设计通用操作方法和策略
基本要求：
掌握基因克隆的基本工具。特别是不同的载体。 克隆基因的基本方法。 怎样利用基因重组技术研究基因的结构、表达和调控。 能够设计一个基因克隆的程序 PCR技术基本原理和应用 能够根据酶切结果判读酶切图谱，以及判读DNA序列的 能力。 利用基因工程生产重组蛋白，基因工程在医药和农业上 的应用。
2.3 基因工程的迅速发展阶段 2.4 基因工程发展过程中的重大事件
2.1 基因工程的准备阶段 理论基础
二十世纪40年代，确定了遗传信息的携带者，即基因 的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的 物质基础问题。
二十世纪50年代，揭示了DNA分子的双螺旋模型和半保 留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。
（用DNA末端转移酶，而非 限制性内切酶）
1980年Nobel化学奖
2. Boyer-Cohen实验
1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡 那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环 素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成 重组质粒，具有双重抗药性。
基因工程第一章 基因工程概论
DNA is the genetic material
The transforming principle is DNA.
1953年，J.Watson和F.Crike创立
DNA双螺旋模型，证实基因是具有 一定遗传效应的DNA片段。
1955年，Benzer在T4噬菌体的顺
反互补实验中，正式使用 “顺反子 （cristron）”这个术语，并将顺反 子与基因在意义上和功能上统一起 来。 同时证实了基因不是最小单位。它 仍然是可分的；并非所有的DNA序 列都是基因，只有其中某一特定的 核苷酸区段才是基因的编码区。
技术上的三大发现
（1）、工具酶的发现和应用
限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志 着DNA重组时代的开始）
1970年，逆转录酶的发现。
（2）、载体的发现及其应用 • 载体主要是小分子量的复制子如：病毒 、噬菌体、质粒。 • 1972年，美国Stanford大学的P. Berg 等首 次成功地实现了DNA的体外重组；
“遗传因子/基因”的设想一经提出， 便推动人们去寻找，去探索
基因在哪里？ 基因是什么？
1910年，美国遗传学家摩尔根
（an）以果蝇为研究材料，发 现了连锁交换定律并提出遗传粒子学说， 第一次将代表某一特定性状的基因与某 一特定的染色体联系起来，即基因位于 染色体上。
1944年，美国微生物学家O.T.Avery 首次证实遗传物质的基础是DNA， 基因位于DNA上。
基因工程的实施至少要有四个必要条件 工具酶 基因 载体 受体细胞
遗传工程 DNA重组 基因工程
区别？
遗传工程是发生在遗传过程中的自然界原 本存在的导致变异的一种现象，及自然 出现的不同DNA链断裂并连接成新的 DNA分子，新的DNA分子含有不同于亲 本的DNA片段。 DNA重组是人们根据遗传工程的原理利用 限制性内切酶在体外对于DNA进行的人 工操作，构成杂种DNA，在自然界一般 不能自发实现。
基因工程概述
PCR（polymerase chain reaction）:聚
合酶链式反应.是以DNA变性、复制的某些特性 为原理设计的.1988，K.Mulllis莫里斯发明。
前提条件是必须对目的基因有一定的了解， 需要设计引物。
高温变性 低温退火(复性) 中温延伸
3.通过化学方法直接人工合成
第二步： 制备重组DNA分子
2.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（ B ）
A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二 酯键 B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形 成磷酸二酯键 C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键 D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起 来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行连接
DNA分子杂交技术 分子探针
检测目的基因是否转录出mRNA
• 最后： 检测目的基因是否翻译出蛋白质
• 还要： 个体生物学水平的鉴定
DNA分子杂交技术
• 基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸 片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待 测核酸样品中特定基因顺序的探测。
• 满足：（1）必须是单链，（2）带有容易 被检测出来的标记物。
基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 实质
DNA重组技术 生物体外 基因
DNA分子（基因）水平 剪切 →拼接 →导入 →表达
人类需要的基因产物 基因重组
基因工程的诞生和发展
1944，艾弗里 证明DNA是遗传物质
1970，阿尔伯、 内森斯、史密斯
1953，沃森和克里克 发现DNA双螺旋结构
要切两个切口，产生四个黏性末端。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端，然后让两者的 黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组 的DNA分子了。
合酶链式反应.是以DNA变性、复制的某些特性 为原理设计的.1988，K.Mulllis莫里斯发明。
前提条件是必须对目的基因有一定的了解， 需要设计引物。
高温变性 低温退火(复性) 中温延伸
3.通过化学方法直接人工合成
第二步： 制备重组DNA分子
2.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（ B ）
A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二 酯键 B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形 成磷酸二酯键 C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键 D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起 来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行连接
DNA分子杂交技术 分子探针
检测目的基因是否转录出mRNA
• 最后： 检测目的基因是否翻译出蛋白质
• 还要： 个体生物学水平的鉴定
DNA分子杂交技术
• 基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸 片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待 测核酸样品中特定基因顺序的探测。
• 满足：（1）必须是单链，（2）带有容易 被检测出来的标记物。
基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 实质
DNA重组技术 生物体外 基因
DNA分子（基因）水平 剪切 →拼接 →导入 →表达
人类需要的基因产物 基因重组
基因工程的诞生和发展
1944，艾弗里 证明DNA是遗传物质
1970，阿尔伯、 内森斯、史密斯
1953，沃森和克里克 发现DNA双螺旋结构
要切两个切口，产生四个黏性末端。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端，然后让两者的 黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组 的DNA分子了。
第一章 基因工程第1节 基因工程1
1．如何将目的基因导入受体细胞 中呢？ 2．通常所用的载体是什么？它是 一种什么样的物质？ 3．在实际工作中，怎样判断重组 DNA已导入受体细胞? 4．除了质粒外，还有其他结构可 以充当运输目的基因的“运输车” 吗? 5．在基因工程中使用的载体应该
基因进入受体细胞的载体—— “运载工具”
常用的载体： 质粒、噬菌体和某些动、 植物病毒 最常用的质 大肠杆菌的 最常用的载体 质粒； 粒是： 质粒 是：
一 基因工程的诞生 和发展
DNA是遗传 物质 DNA分子双螺 旋结构 破译遗传密 码
艾弗 里
基因工程的概念
基因工程又称为重组DNA技术。
是指在体外通过人工“剪切” 和“拼接”等方法，对生物的 基因进行改造和重新组合，然 后导入受体细胞，并使重组基 因在受体细胞中表达，产生人 类需要的基因产物的技术。 包括基因的分离、体外重 组转移及在受体细胞内的复 制和表达等过程。 基因工程是在基因水平上进行设计
A A C G T T G C T T A A A A C G
A A T T C T T
G A A
A A T T C G T G CAT T G C T T A A
【例2】限制酶在DNA的任何部位都能 将DNA切开吗?以下是四种不同限制酶 切割形成的DNA片段：
你能用DNA连接酶将它们连接起来吗? （ （ 请将结果写在下列横线上。 1 ） 和 5） 能连接形成 （ ； （ 7） 能连接形成 2 ） 和 （ ； （ 6 ） 能连接形成 3） 和 （ ； （ 8） 能连接形成 4） 和 。
目前已经发现了500多种限制性核
限制性内切酶作用示意图
A A C C C G G GG C T
T T G GG G C C C C A
【基因工程基础知识】
第一章基因工程第一节基因工程概述由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。
二．基因工程的基本工具（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（二）“分子针线”——DNA连接酶1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。
(三)“分子运输车”——载体1.载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。
三．基因工程的基本过程(一) 获得目的基因（目的基因的获取）1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。
②用人工的方法合成。
★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
2.利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
HXY-第一章-基因工程概述
连锁遗传规律的提出
1910年，Morgan T.H.等以果蝇为研究材料，提出了 基因的连锁遗传规律。说明了基因是在染色体上占有 一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质 内涵。
显性等位基因 隐性等位基因
纯合子
纯合子
杂合子
同
同 一
源 染 色
性体
状 的 两 个
分 别 带 着
等控
位制
基
因
4. 顺反子阶段
5.目的基因表达 使导入寄主细胞的目的基因表达出我们 所需要的基因产物。
基因分 离酶
重组克隆的选择
导入
植物
导入细菌
细胞
序列分析和基 重组质粒繁殖 因表达等研究
基因工程研究的基本技术路线
1.2 基因工程的兴起
1977年，激素抑制素的发酵生产成功。 1978年， Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。 1979年， Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。 1980年， Nagata等， 遗传工程菌生产干扰素获得成功。 1981年， 用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝 炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。 1982年， 重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。 1983年， 基因工程生产狂犬病疫苗取得突破型进展。
提出了原核基因调控的 操纵子模型
（operon model）。
三、基因工程诞生的技术突破
1. 限制性内切酶（restriction endonucleases） 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制 性核酸内切酶。
Daniel Nathans
Werner Arber 理论预见限制酶
Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶
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后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同 pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在 菌体内成功转录出相应的mRNA。这是 第一次成功的基因克隆实验。
Boyer-Cohen 实验
Stanley Cohen 1986 Nobel 生理 或医学奖
Herb Boyer
五、基因工程的特征 1. 跨物种性 外源基因到另一种不同的生物细胞内 进行繁殖。 2. 无性扩增
1980年Nobel化学奖
四、基因工程的诞生 1. Berg的开创性实验 1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成 了首次体外重组实验： 将SV40的DNA片断与噬菌体的 DNA片断连接起来。
1980年Nobel化学奖
2. Boyer-Cohen实验 1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡 那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含 有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒 pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。
5.现代基因阶段
1）操纵子 （启动基因＋操纵基因＋结构基因）
2）跳跃基因
指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方， 它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个 位置。
3）断裂基因
1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不 连续的间断基因被称为断裂基因。
4）假基因
重组质粒繁殖
基因工程研究的基本技术路线
1.2
基因工程的兴起
1977年，激素抑制素的发酵生产成功。
1978年， Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。
1979年， Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。 1980年， Nagata等， 遗传工程菌生产干扰素获得成功。
1981年， 用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝 炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。
19. 胚胎干细胞（ESC）
20. 差异显示 21. 内含肽（intein）及其应用 22. 限制性内切梅 23. 基因工程载体 24. 生物软件及其使用 25. 基因工程相关的网站 26. 人类基因组计划（HGP） 27. 基因工程产物的纯化策略（载体） 28. 基因工程对中国经济的影响
29. 发达国家中的基因工程发展及现状 30. 基因工程的社会安全及伦理问题 31. 制作基因工程网站 32. 目前流行的传染性疾病的基因工程治疗思考 33. 核糖体展示技术（ribosome display）
基因工程(gene engineering) 常和以下名称混用:
生物工程 遗传工程 基因工程 biological engineering genetic engineering gene engineering 分子克隆 molecular cloning 基因克隆 gene cloning 基因操作 gene manipulation 重组DNA技术 recombinant DNA technique
原核生物的基因调控操纵子模型
1961年，Jacques Monod和 Fancois Jacob 提出了原核基因调控的 操纵子模型
（operon mo 限制性内切酶（restriction endonucleases） 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制 性核酸内切酶。
6. DNA测序 7. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
8. 遗传病的基因治疗
9. 噬菌体展示 （phage display）
10. 酵母双杂交及其衍生系统 11. 基因疫苗 12. 基因打靶 （gene15. 转基因动物 16. 定点突变 17. 细菌表面呈现（Bacterial surface display） 18. 动物克隆
同 一 性 状 的 两 个 等 位 基 因
显性等位基因 隐性等位基因 纯合子 纯合子 杂合子
同 源 染 色 体 分 别 带 着 控 制
4. 顺反子阶段
1957年，本泽尔(Seymour Benzer)以T4噬菌 体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细 结构，提出了顺反子（cistron）概念。 顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1 条多肽链。
外源DNA在寄主细胞内可大量扩增， 和高水平表达。
六、基因工程的主要操作内容 1. 目的基因的获取 从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或 PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的 DNA片断。 2. 重组体的制备 将目的基因的DNA片断插入到能自我复制 并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体 分子上。
二、基因工程诞生的理论基础 1 . DNA是遗传物质 （1）肺炎双球菌转化实验 1944年 Avery，确定了基因的分子载 体是DNA，而不是蛋白质。 （2）噬菌体转染实验
1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。
1928年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染 小白鼠实验。
Daniel Nathans Werner Arber Hamilton O. Smith 用限制酶切得 理论预见限制酶 得到第一个限制酶 SV40 DNA片断
1978年Nobel生理或医学奖
2. DNA连接酶（ligase） 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连 接酶。 3. 载体（vector）
Mendel提出：生物的某 种性状是由遗传因子负责 传递的。是颗粒性的，体 细胞内成双存在，生殖细 胞内成单存在。遗传因子 是决定性状的抽象符号。
孟 德 尔 分 离 律
孟 德 尔 自 由 组 合 律
黄圆 绿圆 黄皱 绿皱
3. Morgan的基因阶段
1909年丹麦遗传学家 Yohannsen (18591927) 发表了“纯系学说”首 先提出了“基因(gene)” 的概念，代替了Mendel “遗传因子” 的概念。 但没有提出基因的物质 概念。
不能合成出功能蛋白质的失活基因 。
5）重叠基因
不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的 即重叠的。
现代对基因的定义是：DNA分子中含有特定遗传信息 的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
基因的特点 :
不同基因具有相同的物质基础 基因是可以切割的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代
1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬 菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。
4. 感受态体系 1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化 钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。 1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同 样能吸收质粒DNA。
5. 琼脂糖凝胶电泳 1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同 长度的DNA分离开。 6. DNA测序技术 1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert 发明了DNA快速测序技术。
基因工程的诞生和发展
泛基因阶段1
孟德尔遗传因子阶段2
基因
的研究
摩尔根的基因阶段3
顺反子阶段4 现代基因阶段 5
2. Mendel的遗传因子阶段
Mendel G.J. (1822-1884). 1856-1864豌豆杂交实验。
1866年发表论文，提出分离规 律和独立分配规律 1900年Mendel遗传规律被重新 发现。遗传学的元年
3.重组体的转化 将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
4.克隆鉴定 挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
5.目的基因表达 使导入寄主细胞的目的基因表达出我们 所需要的基因产物。
基因工程的基本流程
基因和载 体连接
基因分 离酶切
载体酶切
重组克隆的选择 导入细菌
导入 植物 细胞
序列分析和基 因表达等研究
小综述推荐内容和写作要求
1. 每人从中任意选择一个大题目（也可以自 己另选一个题目），或在大题目下自己立一 个分题目，但不能与其他人重复。 2. 每个题目都要写出原理、产生、发展历 史、现状、发展趋势、理论或实践意义。
3. A4纸打印。
推荐小综述题目
1. 单色和多色荧光原位杂交（FISH） 2. RNA干扰（RNAi）及其应用 3. 生物芯片（chip） 4. 基因扩增（PCR） 5. 基因库（gene bank）及序列的查询和分析
（1）S型：注射小白鼠，死亡。 （2）S型，65℃ 加热：注射小白 鼠，活。 （3）R型：注射小白鼠，活。 （4） 65℃ 加热S型+R型：注射小 白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。
40年代，DNA是遗传物质被证实
1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公 开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。 （1） S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可 使R型菌转变成S型菌； （2）经DNase 处理的S型菌无细胞提取物失去 了转化作用。 （3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍 有转化作用。 不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA 可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作 被称为是现代生物科学的革命性开端。
2. DNA双螺旋结构 1953年James D. Watson和 Francis H. C. Crick揭示了 DNA分子的双螺旋结构和 半保留复制机制。
分子遗传学的诞生
3. 中心法则和遗传密码 1957年Crick又提出了遗传信息传递的 “中心法则” DNA RNA
protein
1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码
植物基因工程的发展迅速
First transgenic plant First Bt corn plants Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized
显微镜技术与染色技术的发展，使 人们注意到，细胞分裂时，尤其是减 数分裂中，染色体的行为和孟德尔提 出的等位基因的分离规律相当一致， 所以，确定基因在细胞核中，在染色 体上。