拟南芥过表达

学院：生命科学学院专业：植物学姓名：乔亚飞学号：216021001 Overexpressionof SsCHLAPXs confersprotectionagain stoxidativestressinducedbyhighlightintransgenicArabi

dopsisthaliana

盐地碱蓬CHLAPXs基因在拟南芥中过表达可以保护由强光引起的

氧化应激

作者：Cai-HongPang,KeLiandBaoshanWang

期刊：PhysiologiaPlantarum

影响因子：3.52

摘要：为了研究抗坏血酸过氧化物酶（CHLAPX）在活性氧清除系统中的作用的重要性，本实验克隆了盐地碱蓬chlapx（sschlapx）编码基质APX（sAPX）和类囊体膜APX（tAPX）。基质sapx 的cDNA 由1726个核苷酸组成，其中包括一个1137bp开放阅读框（ORF），编码378个氨基酸。类囊体tapx 的cDNA由1561个核苷酸组成，包括1284bp的开放阅读框，编码427个氨基酸。ss.sapx与ss.tapx 氮端378个氨基酸是相同的，而炭末端49种氨基酸不同。通过农杆菌转化法将apx转入到拟南芥中，用高光（1000μmolm−2−1）处理转基因株系。研究结果表明在强光下，转基因株系的Fv/Fm和叶绿素含量在正常光照下差异较小，但是在强光处理下过表株系均显著高于野生型。这些结果表明，在强光胁迫下，SsCHLAPX对叶绿体中活性氧的清除起着重要的作用。

APX同工酶大致可以分为四类：细胞质型APX(cAPX)、叶绿体型APX(chlAPX)、线粒体型APX（mitAPX）和微体型APX(mAPX)。chlAPX具有两种类型的同工酶：基质型(sAPX)和类囊体(tAPX)。之前有报道称拟南芥tAPX和豌豆APX基因在烟草中过表达可以降低百草枯对其产生的氧化胁迫(Murgiaetal.2004,Yabutaetal.2002)。烟草中APX基因的过表达无法缓解臭氧产生的胁迫(Torsethaugenetal.1997)。

研究的目的：第一，验证APX酶是否具有清除活性氧的功能；第二，研究APX基因的表达部位。

13.在高浓度50%(w/v)甲酰胺缓冲液中,准备使用一个随机引物标记工具32p探针标记DNA。杂交袋至于65℃中洗膜，待印记变干后取出，在-70℃下进行底物显色。

14.探针对转录结果的分析显示SsCHLAPX放大了以下引物:SsCHL APX-f（顺序）(5 -GTCGTCAAACCCAACCAACCTCCTC-3 )and SsCHLAPX-r（逆序）(5 -ACTCTTGCCGGATGAATACTTGG-3 ).

探针对转基因拟南芥转录结果的分析显示sAPX/tAPX放大了以下引物Ss.sAPX/Ss.tAPX-f(5 -GTCGTCAAACCCAACCAACCTCCTC-3 )AndSs.sAPX/Ss.tAPX-r(5 -TGCCTCATAGAATCCGACAGCT CAC-3 ).

拟南芥载体的构建与转化

15.构建转基因载体，采用GATEWAY技术（一种大规模克隆技术）在CaMV35S启动子的控制下将拟南芥中的整条sAPX和tAPX脱氧核糖核苷酸克隆（整合）到AMBIA1300。利用农杆菌侵染法将质粒载体克隆到拟南芥中。

利用PCR检测转基因

16.根据Yabuta等的方法从野生型和转基因拟南芥中提取基因组DNA样本，利用以下引物通过PCR扩增tAPXandsAPX当中的100ng的基因组DNA。

Ss.sAPX/Ss.tAPX-f(5 -GTCGTCAAACCCAACCAACCTCCTC-3 )

AndSs.sAPX/Ss.tAPX-r(5 -TGCCTCATAGAATCCGACAGCTCAC -3 .)

制备粗酶提取物

17.粗酶是根据Rao等人的方法从野生型和转基因拟南芥的叶子中提取。（K-phosphatebuffer和M-phosphatebuffer分别是碱性和中性磷酸缓冲液）1g新鲜的叶子放于4℃的2ml溶液中。50mMl−1的碱性磷酸缓冲液,PH7.8，5mMl−1的EDTA（乙二胺四乙酸）和2mMl−1的AsA。匀浆在4℃下15000转离心15min。测定上清液中蛋白质含量,过氧化氢酶,抗坏血酸过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

强光照射处理

18.将转基因和野生型拟南芥的叶子剪下来至于卤钨灯下(1000μmol m−2s−1)照射2h，灯与样品之间加以流动的水来滤除红光来阻止叶子受热。对照组的叶子至于含水的培养皿中在强光90μmolm−2s−1的条件下照射2h。

抗氧化酶实验（分析）

19.过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性的测定分别根据Raoetal.(199 7)andGiannopolitis的方法。APX的测定根据JimenezetalandRies(1 997)的方法。蛋白质含量的测定根据Bradford(1976)的方法，以牛血清蛋白为标准。

脂质过氧化作用分析（脂质过氧化作用（LipidPeroxidation）是指多不饱和脂肪酸和脂质的氧化变质。脂质过氧化作用能对细胞膜、脂蛋白以及其他含脂质结构产生严重的损害，例如使细胞膜的流动性以及

渗透性发生改变、损伤DNA以及蛋白质，进而影响细胞正常功能。人类的许多疾病，如肿瘤、血管硬化及衰老现象都涉及脂质过氧化作用）

20.拟南芥在强光下与非强光环境下叶子中过氧化脂质蛋白的含量以丙二醛(MDA)含量为参照，根据Gueta-Dahan等人的方法（略有修改）用硫代巴比妥酸（TBA）测定MDA的含量（1997）。简略说就是将0.1g的叶子(鲜重)放于1.5毫升0.1%三氯乙酸(TCA)和1.5毫升0.5%硫代巴比妥酸的，沸水煮10分钟后在自来水冷却,然后在1400转下离心15min。MDA浓度计算基于吸光度A532,吸光度A600和它的摩尔吸光系数，公式如下:（FW鲜重）

MDAcontent(μmol/gFW)=(A532-A600)×103×提取液体积(ml)/1.5 6×105×样品鲜重(g)

过氧化氢染色

21.拟南芥的叶子在用DAB（二甲基联苯胺）染色过程中，内源性过氧化物酶会在原位产生过氧化氢。将拟南芥的叶子取下来至于1mg/ ml（PH3.8）的DAB溶液中光照8小时，之后，将叶子在96%沸腾的乙醇中浸泡10min并转移到96%的乙醇中保存。过氧化氢产物可以通过染色的颜色（红棕色）直观的看出来。

叶绿素含量