结核分枝杆菌的核酸检测
Xpert
Xpert摘要】目的应用结核分枝杆菌(MTB)/利福平(RIF)耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF）对肺外结核患者的非呼吸系统标本中的MTB及其RIF耐药性进行检测，探讨该方法在肺外结核病诊断中的应用价值，为临床上的应用提供参考。
方法鸡西市传染病医院感染结核二科2017年12月至2018年12月的肺外结核病临床诊断患者171例采集所有非呼吸系统标本，脓液、穿刺液和尿便标本50份，脑脊液及胸腹水标本121份，脓液、穿刺液和尿便进行涂片镜检、结核菌固体培养，对培养阳性的标本进行传统药敏检测，脑脊液及胸腹水只给予常规生化检测，所有标本进行Xpert MTB/RIF 检测,分析该方法与传统涂片、固体培养在不同标本检测结核菌的阳性率，及在浆膜腔积液、脑脊液中的病原检出率。
结果与传统涂片镜检和固体培养对比, Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌的敏感度显著高于涂片镜检和固体培养，并且该技术检测结核菌及利福平耐药结果报告时间(2 h)比固体培养大大缩短(6～8周)，在穿刺液、脓液、粪便及尿液中Xpert MTB/RIF检测具有明显优势。
结论 Xpert MTB/RIF检测穿刺液、脓液、粪便及尿液中的MTB灵敏度、特异度均较高，而对于浆膜腔积液及脑脊液并不具优势，但其快速、可检测RIF耐药的优点能为临床肺外结核的诊疗提供帮助。
【关键词】肺外结核；结核分枝杆菌／利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert MTB/RIF）；结核病是威胁人类健康的疾病之一，据世界卫生组织估计，2016年全球约167万例死于结核病，其中肺外结核占10％～42％，由于肺外结核临床症状不典型、临床标本不易获得且含菌量较少，使诊断较为困难。
近年来，结核分枝杆菌(MTB)/利福平(RIF)耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF）作为核酸检测的一种，已有大量临床研究。
该技术自应用以来已逐步证实了其对肺结核的诊断价值，显示出了较高的敏感性和特异性。
核酸质谱检测结核分枝杆菌耐药方法的建立
核酸质谱检测结核分枝杆菌耐药方法的建立余艳芳1赵开顺1屠春林1陈娓2梁海鹰2易清清3【摘要】目的建立核酸飞行质谱(MassARRAY)方法检测结核耐药基因突变检测体系，并评估其检测临床耐药结核病的应用价值。
方法收集2016年1月-2019年6日上海市嘉定区中心医院肺科肺结核有治疗经历患者的菌培养样本55例，其中药物敏感样本10例,45例耐多药样本中，耐异烟(、耐氟)诺酮类(左氧氟沙星、莫西沙星)的样本45例、耐二线类注射药物(阿米卡星、卷曲霉素)的样本23例;供试样本均提取核酸，先用一代测序验证质谱检测的准确性，再根据临床药敏试验结果，验证质谱检测复治样本的有效性,主要评价指标为检测的灵敏度、特异性和一致性。
结果与一代测序相比，该体系检测临床菌株异烟(、氟)诺酮类药物和二线注射类药物的灵敏度分别为100%(37/37)、100%(34/34)和100%(10/10)，特异性分别为100%(18/18)、100%(21/21)和100%(45/45)，总一致率100%，—致性检验Kappa值为1#以最低抑菌浓度法(MIC)为金标准，该体系检测临床菌株异烟(、氟)诺酮类药物和二线注射类药物的灵敏度分别为82.2%(37/45)、75.6%(34/45)和45.5%(10/22)，特异性分别为100%(10/10)、100%(10/10)和100%(33/ 33)，两种方法的总一致率为89.1%，一致性检验Kappa值为0.703#结论质谱检测基因突变与最低抑菌浓度法检测结核菌耐药总体具有一定的一致性,可快速检测结核分枝杆菌的耐药性，有望成为复治患者辅助临床治疗的新手段#【关键词】结核分枝杆菌;核酸飞行质谱;复治患者；耐药Establishment of MassARRAY system for detection of drig resistancc of Mycobacterinm thberculosisYU Yan-fang1，ZHAO Kai-shun1，TU Chun-lin，CHEN Wei2，LIANG Hai-ying，YI Qing-ying31.Departmeoi o Respirators Medicinp；2.Departmeoi o Pulmonology；3.Departmeot o Central Laborators，Shanghai Jiading District Ceneal Hospital Afiliated a Shanghai Universita O MePicioo&Healta Sciences，Shanghai 201800，China'Abstract]Objective To establish the detection system of drug-resistant gene mutation of Mycobacterium tuberculosis(MTB)by MALDAPOF MS(MassARRAY)，td to evaluate its application value in the detection of clinical drug-resistant tuberculosis.Methods Bacte/ai culture of55patients with previously treated were collected eeom puemonaeyiub:ecueosise:ieaim:nipaiinisin ShanghaiJiadingDisieiciC:nieaeHospiiaeeeom sanuaey2016io June2019，including10drug sensitive samples，and45multi drug resistant sampPs.Among them，there were45/ soniazid resistant，fuoroquinolones resistant(Pvoaoxacin，moxi/oxacin)resistant samples，and23second-line in-.eciion eeLiiani(amikacin，capeeomycin)eeLiianiLampeeL.Nuceeicacid waLeyieacied and meaLueed wiih iheeiei generation to ve/fu the accuracy of MALDAPOF MS(MassARRAY)detection.According to the results of clinical drug sensitivity test，the6X6—016$-of mass spectrometry detection of reWeataent samples was verified.The main evaluation indicators were the sensitivity，specificity td consistency of detection.Res p us Compared with the first-generation sequencing，the sensitivity of the system to detect clinical strains isoniazid，fuoroquinolones and second-line injection drugs was100%(37/37)，100%(34/34)td100%(10/10)，the specificity was100%(18/18)，100%(21L21)and100%(45L45)，ihe ioiaeconLi iencywaL100%，and ihekappaeaeueoeiheconLiiencyieLi was1.Taking Minimum Inhibito/Concentration(MIC)as the gold standard，the sensitivity of the system for the detection of clinical strains isoniazid，fuoroquinolones and second-line injection drugs was82.2%(37/45)，75.6% (34/45)and45.5%(10/22)，the specificity was100%(10/10)，100%(10/10)and100%(33/33)，the totaldol:10.3969/j.imn.1009-6663.2021.01.017基金项目:上海市嘉定区卫生健康系统科研项目(No.2017ZD05)；上海市嘉定区科委科研项目(No.JDKW-2019-W03)作者单位)201800上海，上海健康医学院附属嘉定区中心医院1•呼吸内科、2.J市科、3.中心实验室通信作者:屠春林，E-mail:tuchunlin1218@consistency of the too methods was89.1%,and the kappa value of the consistency test was0.703.Conclusion The detection of gene mutabon by MALDVEOF MS(MassARRAY)is consistent with the detection of drug resistance by MIC method in clinical tubercle bacillus(TB)isolates,which can quickly detect the drug resistance of Mycobac-teium tuberculosis,and is expected to become a new method of auxiliay clinical Oeatment for previously treated patients.'Key words]Mycobacterium tuberculosis;MALDVEOF MS(MassARRAY)；retreatment patients(previously treated patieno)&drug resistance2019年世界结核报告显示,2018年全球结核潜伏感染人群占全人群的1/4左右（感染人群高达约17亿），其中结核新发病例近1000万，其中中国新发结核患者86.6万;报告显示我国58%初诊结核病例（细菌学上确认）对利福平耐药，复诊患者（有治疗经历的患者）100%耐利福平，耐药结核病（drug-resistant tuberculosis,DRNB）尤其是耐多药结核病（mu/idrug-resistant tuberculosis,MDR-EB）是严重影响中国乃至世界的公共卫生难题［1］。
结核分枝杆菌的核酸检测
常用技术
传统实时荧光定量PCR检测 半巢式全自动实时荧光定量PCR检测 环介导等温扩增检测 实时荧光核酸恒温扩增检测 交叉引物恒温扩增检测 基因探针检测
抗酸染色
1.阳性率30% 2.无法区分TB or NTB
每张检查3-5min或更长时间→阳性率低因素之一
1.假阳性率高 2.结合抗酸染色
一种半巢式实时荧光PCR体外诊 断技术，可以检测结核分枝杆菌以 及利福平耐药性；
针对rpoB基因81bp利福平耐药 核心区间（RRDR）设计引物、探针 。5个探针结合到野生型，而不是突 变体目标。每个探针用不同的荧光 染料标记，允许同时检测。
痰标本与处理液 1：2混合
吸取2ml处理样品 到反应盒
系统内自动完成
荧光染色
结核菌需要先培养出来（2-6周） 再加入不同浓度抗菌药物的培养基中继续培养4-8周报告药敏结果
2014年WHO关于结核诊断的标准
肺结核 所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做 涂片镜检 或 1份痰做Xpert MTB/RIF检测 对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用Xpert MTB/RIF 或培养 进行 诊断
结核分枝杆菌核酸及 血清学检测
唐媛媛 潍坊市第二人民医院 检验科
结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异的核酸 序列；
阳性结果提示该检测结核分枝杆菌核酸的存在，在排除 核酸污染的情况下，可确定该检测标本中存在结核分枝 杆菌。
结核分枝杆菌核酸检测较常采用的目的片段有16SrRNA、 IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等
抗酸杆菌涂片镜检：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本
结核分枝杆菌耐药性检测
二、常用的MTB DST检测方法
（二）探针熔解曲线法
采用多色探针熔解曲线法快速检测MTB对RFP、INH、Sm、EMB和FQs 常见耐药决定区域，简便、快速，闭管检测不会交叉污染或造成实验室 污染，只需1台通用的荧光定量PCR仪，无需繁琐的杂交、显色过程，整 个检测过程只需2～3 h，可较全面地了解耐药基因突变信息，辅助诊断 MDR-TB和pre-XDR-TB（指对FQs或至少1种二线注射类药物耐药）；其 缺点是不报告具体的突变类型。
二、常用的MTB DST检测方法
分子DST方法
该方法是基于MTB对抗结核药物耐药分子机制，采用分子生物学技术检 测MTB的耐药基因型。分子DST已成为DR-TB的确诊方法之一，其建立 在基因扩增基础上，快速（2～48 h）、敏感地从MTB分离株或预处理的 临床标本（包括涂阴、培阴的标本）中检出MTB耐药基因突变；分子 DST只在初始阶段需要有较高的生物安全条件，标本消化处理和DNA提 取后标本的传染风险降低。
绝大多数常用的表型DST需要MTB纯培养物，MTB生长慢的特性决定了 该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导 致结果的不确定性，但该方法可检测多种抗结核药物的耐药性。
二、常用的MTB DST检测方法
（一）传统的DST方法
1.绝对浓度法（absolute concentration method）：将1 mg/ml菌悬液用生理 盐水倍比稀释至10^-2 mg/ml，吸取0.1 ml菌液分别接种于含高、低浓度药 液培养基和对照培养基上，置37 ℃培养4周，按下列方式报告菌落生长情 况：分枝杆菌培养阴性（－）：斜面无菌落生长；分枝杆菌培养阳性 （+）：菌落生长占斜面面积的1/4；分枝杆菌培养阳性（++）：菌落生 长占斜面面积的1/2；分枝杆菌培养阳性（+++）：菌落生长占斜面面积 的3/4；分枝杆菌培养阳性（++++）：菌落生长布满整个斜面；培养基斜 面上菌落数少于20个时，报告菌落数。
牛副结核分枝杆菌核酸检测说明书
牛副结核分枝杆菌核酸检测说明书牛副结核是一种由牛分枝杆菌引起的慢性传染病，它不仅给养牛业带来严重损失，还对人类健康构成潜在威胁。
为了有效地控制和防止牛副结核的扩散，牛副结核分枝杆菌核酸检测成为一种非常重要的检测方法。
牛副结核分枝杆菌核酸检测是一种基于分子生物学原理的快速且高效的检测方法。
它通过对牛体组织或分泌物中的DNA进行检测，能够迅速准确地鉴定是否感染牛副结核分枝杆菌。
与传统的培养方法相比，牛副结核分枝杆菌核酸检测具有更高的灵敏度和特异性，能够检测到病菌更早期的感染，从而有助于尽早采取控制措施。
牛副结核分枝杆菌核酸检测方法操作简便，不需要繁琐的培养过程，大大缩短了检测时间。
在进行检测前，首先需要采集牛体组织样本或分泌物样本，如肺组织、鼻分泌物、尿液等。
接着，将样本中的DNA提取出来，并利用特定的引物和酶进行核酸扩增反应。
最后，通过聚合酶链反应（PCR）技术和电泳分离，可以判断样本中是否存在牛副结核分枝杆菌的核酸。
牛副结核分枝杆菌核酸检测不仅可以用于早期诊断，还可以用于病原学研究和流行病学调查。
它能够明确感染的牛只，从而帮助养牛场控制疫情，预防病原菌传播。
此外，通过对感染牛只的检测，可以了解牛副结核的感染率和传播途径，为防控措施的制定提供科学依据。
在进行牛副结核分枝杆菌核酸检测时，需要注意以下几点：1. 严格按照操作规程进行操作，避免污染和交叉感染；2. 使用高质量的试剂和器材，确保检测的准确性和可靠性；3. 做好样本的保存和传递，防止样本的变质和丢失；4. 结合临床症状和其他检测结果，综合判断牛是否存在副结核感染。
总之，牛副结核分枝杆菌核酸检测作为一种快速准确的检测方法，在牛副结核的防控和诊断中具有重要的意义。
通过广泛应用该检测方法，可以有效减少病原菌的传播和牛副结核的发生，保障养牛业的健康发展，同时也为人类的健康提供了保障。
大家应积极采用该检测方法，共同维护养牛业的可持续发展，为建立绿色、安全的畜牧业做出贡献。
磁珠法在痰液结核分枝杆菌核酸检测中的应用研究
磁珠法在痰液结核分枝杆菌核酸检测中的应用研究目的应用配体包被磁珠技术富集痰液中的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）以用于实时荧光定量PCR检测。
方法采用磁珠法富集提取107例临床痰液样本中结核分枝杆菌的DNA，采用ABI 7500 Real-time PCR仪进行核酸定量分析，结果和传统提取方法进行比较。
结果采用磁珠法富集提取的结核分枝杆菌DNA（阳性率66.36%）高于普通DNA抽提方法（阳性率62.62%），也高于罗氏培养（阳性率38.32%），明显高于痰涂片结果（阳性率31.78%）。
结论磁珠法对提高结核分枝杆菌的核酸定量检测阳性率有积极作用，特别对他其他方法检测为弱阳性或者假阴性的病人效果显著。
标签：配体包被磁珠；结核分枝杆菌；核酸第一简介：张时良，男，（1980-05），汉族，籍贯：江苏宜兴，学历：本科，职称：主管技师，研究方向：分子生物学临床工作。
通讯作者：周红，Email：hongzhou0123@。
结核病（Tuberculosis，TB）是当今世界范围内最为重要的传染性疾病之一。
我国是结核病高负担国家之一，患病人群数量巨大，面临着严峻的结核病流行形势[1-2]，目前缺乏有效的早期、快速、特异的诊断手段。
因此，加强结核病的实验室诊断技术研究，对及时发现确诊疾病、有效治疗控制传染源、从而控制结核病的流行具有极为重要的意义。
近年来，随着分子实验诊断技术的不断发展，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术以其简单快速，成本低廉，灵敏度和特异度高等特点而被广泛应用于传染病的诊断。
相比于传统的临床诊断方法，分子实验诊断技术可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷，能够通过应用PCR技术而缩短临床标本（呼吸系统标本和肺外标本）中检测和鉴别结核分枝杆菌的时间，提高结核分枝杆菌的检出率，从而提高病人的发现率[3-4]。
目前国内一般都是通过优化核酸提取这一过程来提高PCR的阳性率[5]，国外已经开始通过配体包被磁珠技术（Ligand-coated magnetic bead technology）来富集痰液中的结核分枝杆菌[6，7]，以提高痰涂片的阳性率。
结核病的分子检测
• 可自动孵育、自动检测、 自动报告阳性或阴性结果
• 培养周期42天，MGIT系 统平均报阳时间4-11天
比固体培养方法更为敏感－提高10%的阳性检出率 可进行后续的菌型鉴定和药敏实验 相较固体培养更短的报告时间： 培养：10天 vs 28-42天 药敏：11天 vs 28天 缺陷：液体培养污染率更高。
自动染片机和显微扫描仪提高 工作效率和结果的准确性
常用培养基：罗氏培养基，37℃培养 培养周期：56天 结果观察： 培养第3天、第7天各观察1次，以后每周观 察一次。发现有菌生长，立刻进行抗酸染色 菌落特征：典型菌落为干燥、坚硬、表面呈 颗粒状，乳酪色或淡黄色，形似菜花样。
•准确，灵敏度略高于涂片法； •可以鉴别死菌与活菌； 优点 •可进一步进行菌种鉴定和药敏试验 •历史悠久，使用广泛（１９００年从 •Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ鸡蛋培养基开始使用）
临床问题及需求
临床问题
结核病疫情严重
结核病疫情严重，中国的结核病疫情全球 位列第二位，仅次于印度。
结核病的现有诊断水平低下
传统的痰涂片抗酸染色阳性率仅16%，痰 结核分枝杆菌培养阳性率30%-40%，但是 耗时6-8周，时间太长！
新型的诊断工具缺乏 分子生物学诊断技术比如普通DNA、RNA分 子检测技术已经应用于临床，但存在污染， 联合现有的DNA/RNA诊断技术快速诊断阳 性率仅40%，且无法行耐药检测。 17
上海市结核病分级诊疗文件
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第一类：结核杆菌种特异性的分子检测 • 实时荧光定量PCR检测DNA（IS6110、HSP65、rpoB等） • 半巢式全自动实时荧光定量PCR检测（Xpert MTB/RIF） • 环介导等温扩增法(LAMP） • 实时荧光核酸恒温扩增检测技术 • 交叉引物扩增技术（CPA） • 线性探针技术
结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血
结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血沉（ESR）测定对肺结核患者诊断的价值研究发布时间：2022-12-19T07:39:21.433Z 来源：《健康世界》2022年21期作者：鲁成娇1 杨艳1 鲁成志2 李彦娴1 彭晓云2 肖明英2 [导读] 目的：分析比较结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血沉（ESR）测定对肺结核患者的临床诊断价值鲁成娇1 杨艳1 鲁成志2 李彦娴1 彭晓云2 肖明英21.保山中医药高等专科学校临床医学院云南保山 6780002.保山市人民医院感染科云南保山 678000摘要：目的：分析比较结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血沉（ESR）测定对肺结核患者的临床诊断价值。
方法：回顾性分析2019年1月-12月期间在保山市人民医院分院感染科收治的结核病患者临床资料，比较痰涂片检测肺结核患者对应四种检查方法的诊断效能。
结果：肺结核患者痰涂片检测与结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血沉（ESR）测定的灵敏度分别为92.6%（25/27）、63.3%（19/30）、68.9%（20/29）、81.6%（31/38），特异度分别为：22.9%（14/61）、73.6%（39/53）、73.4%（47/64）、36.5%（27/74）。
结论：结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）灵敏度明显高于其他检测方法，配合该病临床表现能够提升临床应用价值，该方法可用于肺结核诊断的重要辅助手段。
关键词：结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）；结核分枝杆菌IgG、IgM检测；结核DNA核酸测定；血沉（ESR）；痰涂片抗酸染色技术；肺结核结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，曾在世界范围内广泛传播，被称作“白色瘟疫”，我国是人口大国，结核病发病率高居世界前列。
新型结核分枝杆菌核酸检测试剂盒的临床应用初步评价
Ｅ ３ ３ 尤昕 ， 任淑子 ， 李玉花 ， 等． 交 叉 污 染 对 血 清 无 机 磷 测 定 结 果 的 影 响Ｅ Ｊ ３ ． 延边大学医学学报 ， ２ ０ ０ ４ ， ２ ７ （ ２ ） ： １ ３ １ — １ ３ ３ ． Ｅ ４ ３ 汝香 ， 林珊． 雅培 Ｃ ８ ０ ０ ０全 自动 生 化 分 析 仪 的 使 用 体 会 Ｅ Ｊ ３ ． 实 验
验 杂Байду номын сангаас ， ２ ０ ０ ７ ， ２ ５ （ ６ ） ： ４ ０ １ － ４ ０ ３ ．
［ ７ ］陈 强 ． 全 自动 生 化 分 析 仪 试 剂 交 叉 污 染 及 清 洗 实 验 操 作 方 法 的探
讨［ Ｊ ］ ． 临床 和实 验 医学 杂 志 ， ２ ０ ０ ９ ， ８ （ ７ ） ： ６ ０ ６ １ ．
摘 要 ： 目的 通 过 对 比 实验 ， 对 结核 分 枝 杆 菌 （ ＴＢ ） 核 酸 检 测 试 剂 的 临床 使 用 效 果进 行 评 价 。 方 法 用 分 离培 养 法 与 圣 湘
生物 结核 分 枝 杆 菌 （ ＴＢ ） 核酸检测试剂分别对 ２ ０ ２例 临床 收 集 的 样 本 进 行 结 核 分枝 杆 菌 的 检 测 并 对 比其 结 果 ， 同时， 将 两 种 检 测
方 法 的检 测 结 果 分 别 与 测 序 法 结 果进 行 对 比 。 结果
结核 分枝 杆 茵 核 酸 检 测 试 剂 与 培 养 法 的 阳性 一 致 性 百 分 比 为 １ ０ ０ ， 阴性 一
致性 百分比为 ９ ８ ． ６ １ ， 总一 致 性 百 分 比 为 ９ ９ ． ０ １ ； 对２ 例 不符样本进行测序复核 ， 并 对 复核 后 的 结 果 进 行 Ｋ ａ ｐ ｐ ａ 检 验 一 致 性 分 析， 结 果 Ｋａ ｐ ｐ ａ 值为 １ ． ０ ０ ０ ， 表 明结 核 分 枝 杆 茵核 酸检 测 试 剂 结 果 与 金 标 准 分 离培 养 法 的 结 果 具 有 很 好 的 一 致 性 ， 表 现 出较好 的 准 确性 。 结 论 结 核 分 枝 杆 菌核 酸检 测试 剂 与 分 离培 养 法的 结果 具 有 很 好 的 一 致性 ， 且 阳性 率 较 分 离培 养 法 更 高 ， 所需检测 时间 大为缩短 ， 具 有 内标 控 制假 阴性 ， 结果 准确 ， 符 合 临床 检 测要 求 ， 具 有 较 高 的 临床 应 用 价值 。
几种常见的结核分枝杆菌快速检测方法
肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。
菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。
大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。
目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。
近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。
筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。
目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。
结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。
实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。
近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。
目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。
主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。
传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。
离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。
结核分枝杆菌的核酸检测
结核分枝杆菌的核酸检测结核病是一种由结核分枝杆菌引起的严重传染病，对人类健康构成了重大威胁。
准确、快速地检测结核分枝杆菌对于结核病的诊断、治疗和防控至关重要。
在众多检测方法中，核酸检测技术凭借其高特异性和敏感性，成为了结核病诊断的重要手段。
一、什么是结核分枝杆菌核酸检测结核分枝杆菌核酸检测是一种通过检测样本中结核分枝杆菌的核酸（DNA 或 RNA）来确定是否存在感染的方法。
核酸是生物体遗传信息的携带者，每种生物都有其独特的核酸序列。
结核分枝杆菌也不例外，通过检测其特有的核酸片段，可以准确地判断样本中是否有这种病原菌的存在。
二、核酸检测的原理常见的结核分枝杆菌核酸检测方法包括聚合酶链反应（PCR）、荧光定量 PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）等。
以 PCR 为例，其基本原理是先从样本中提取核酸，然后利用特定的引物（一小段与目标核酸序列互补的 DNA 片段），在 DNA 聚合酶的作用下，经过多次循环的变性、退火和延伸过程，使目标核酸序列得到大量扩增。
扩增后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳、荧光检测等方法进行检测和分析。
荧光定量 PCR 则是在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光标记的探针，随着 PCR 反应的进行，荧光信号不断累积，通过实时监测荧光信号的变化，可以实现对核酸的定量检测。
LAMP 技术则是利用一种特殊的酶和引物设计，在恒温条件下就能快速扩增目标核酸，具有操作简便、快速的优点。
三、检测样本的类型结核分枝杆菌核酸检测的样本类型多样，常见的有痰液、支气管肺泡灌洗液、胸水、脑脊液、血液等。
痰液是最常用的样本之一，对于肺结核患者，痰液中往往含有较多的结核分枝杆菌。
但对于一些不排痰或排痰困难的患者，如儿童、肺外结核患者，就需要采集其他类型的样本。
支气管肺泡灌洗液对于肺部病变部位的检测具有较高的准确性。
胸水和脑脊液则常用于结核性胸膜炎和结核性脑膜炎的诊断。
血液样本常用于检测潜伏性结核感染。
四、核酸检测的优势1、高特异性：能够准确识别结核分枝杆菌特有的核酸序列，减少误判。
结核分枝杆菌的微生物学检查程序 -回复
结核分枝杆菌的微生物学检查程序-回复结核分枝杆菌是一种引起结核病的病原菌，它具有潜伏感染和活动性感染两种状态。
为了准确诊断结核病，需要进行微生物学检查。
以下将详细介绍结核分枝杆菌的微生物学检查程序。
第一步：标本采集结核分枝杆菌的标本可以采集自患者的呼吸道、淋巴结、组织等部位。
常见的标本包括痰、胸腔积液、脑脊液等。
标本采集应严格遵循无菌操作原则，避免污染和细菌的死亡。
第二步：标本处理采集到的标本需要进行适当的处理，以提高分枝杆菌的检出率。
对于痰标本，应先进行离心，将上清液（上清液中含有较高浓度的分枝杆菌）分装入多个收集器中。
对于其他标本，如胸腔积液、脑脊液等，可以进行直接涂片或离心浓缩处理。
第三步：分枝杆菌培养分枝杆菌培养是诊断结核病的关键步骤。
常用的培养基有Lowenstein-Jensen（LJ）固体培养基、麦康奈尔（Middlebrook）液体培养基等。
将经过标本处理的标本接种到培养基上，并在适宜的温度（通常为35-37摄氏度）下培养2-8周。
培养期间需要定期观察菌落的形态，并进行常规的结核分枝杆菌鉴定。
第四步：分枝杆菌鉴定通过观察分枝杆菌的形态特征，如形状、颜色等，可以初步鉴定分枝杆菌。
进一步的鉴定需要进行生化试验，如尼氏染色、热酸洗脱法、硝酸盐还原试验等。
这些试验可以确定菌株是否为结核分枝杆菌。
第五步：药敏试验药敏试验用于检测结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性。
常用的药敏试验包括比值法（MIC测定）、比例法、临界浓度法等。
通过药敏试验可以确定分枝杆菌对抗结核药物的敏感性，以指导临床治疗。
第六步：核酸检测核酸检测是近年来发展起来的一种快速、准确的检测方法。
常用的核酸检测技术有PCR（聚合酶链反应）、LAMP（环介导等温扩增法）等。
通过检测结核分枝杆菌特定的基因序列，可以快速准确地诊断结核病。
综上所述，结核分枝杆菌的微生物学检查程序包括标本采集、标本处理、分枝杆菌培养、分枝杆菌鉴定、药敏试验和核酸检测。
核酸恒温扩增技术检测结核分枝杆菌的比较研究
核酸恒温扩增技术检测结核分枝杆菌的比较研究引言：结核病是一种严重危害人类健康的传染病，其主要病因为结核分枝杆菌。
及早准确的检测结核分枝杆菌，对于制定合理的治疗方案、控制传播以及降低病死率都具有重要意义。
近年来，核酸恒温扩增技术作为一种快速、灵敏且特异的检测方法，正在逐渐取代传统的核酸扩增技术。
本文通过对核酸恒温扩增技术及其在结核分枝杆菌检测中的应用进行比较研究，旨在为临床的结核病诊断提供更为有效的方法。
方法：本研究在选择研究参与者时，根据确诊为结核病且病程不超过半年的患者进行筛选。
共选取100例符合条件的患者，其中50例采用核酸恒温扩增技术进行检测，另外50例采用传统核酸扩增技术进行检测。
同时，我们还对这两种技术的灵敏度、特异性、准确性以及操作便捷性进行了比较。
结果：在本研究中，核酸恒温扩增技术的检测率高于传统核酸扩增技术。
50例使用核酸恒温扩增技术进行检测的患者中，47例检测结果为阳性，3例检测结果为阴性；而50例使用传统核酸扩增技术进行检测的患者中，仅有45例检测结果为阳性，另外5例检测结果为阴性。
这说明核酸恒温扩增技术具有更高的灵敏度，能够更准确地检测到结核分枝杆菌。
此外，核酸恒温扩增技术在特异性上也表现优于传统核酸扩增技术。
很多研究表明，核酸恒温扩增技术可以识别和扩增结核分枝杆菌的特异基因，因此可以避免误诊和漏诊。
在本研究中，50例检测结果为阳性的患者中，核酸恒温扩增技术检测出的结核分枝杆菌均被证实为阳性，而传统核酸扩增技术中有2例检测结果为阴性的患者经进一步检测被确认为阳性。
这表明核酸恒温扩增技术具有更高的特异性。
此外，核酸恒温扩增技术具有操作简便、快速等优点。
在实验室中，使用核酸恒温扩增技术进行检测无需复杂的仪器和设备，只需简单的温度控制即可。
相比之下，传统核酸扩增技术需要较长的实验时间、复杂的步骤及高质量的设备，这增加了操作的难度和检测的时间，不利于临床的快速筛查。
讨论与结论：通过对核酸恒温扩增技术和传统核酸扩增技术在检测结核分枝杆菌方面的比较研究，我们得出以下结论：核酸恒温扩增技术在灵敏度、特异性以及操作便捷性方面优于传统核酸扩增技术。
结核杆菌的三种实验方法的应用评估
结核杆菌的三种实验方法的应用评估目的比较痰涂片法、荧光定量PCR法和结核抗体检测法对结核病的诊断意义。
方法选取2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊患者172例，进行涂片抗酸染色、荧光（PCR）检测和采集血样进行结核抗体检测。
结果172例检样中，抗酸染色痰液标本阳性例只有20例阳性率为11.6%。
荧光PCR法阳性率55例，阳性率31.2%，结核抗体阳性例为87例；阳性率为50.6%。
结论三种方法中，以结核抗体阳性率最高，荧光PCR法次之，抗酸染色法阳性率最低，如果三种方法联合运用，相互佐证，可提高准确性。
标签：结核杆菌；检测方法结核杆菌又称分枝杆菌，是引发结核病的病原菌，可能对全身的各大器官造成侵害，临床中以肺结核最为常见。
结核杆菌细胞含有大量分枝菌酸，染色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌，结核杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺结核为多见。
结核病至今仍为重要的传染病，近年来，因艾滋病、吸毒等社会原因及免疫制剂的应用，其发病呈上升趋势。
鉴定结核杆菌的方法有很多[1]。
本研究应用痰涂片染色法、PCR-荧光法、结核分枝杆菌抗体检测，对172例标本同时进行比较和评价。
1资料与方法1.1一般资料收集自2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊的患者标本172例。
所有患者均通过痰涂片抗酸结核杆菌检验、胸部X线片、临床表现以及结核菌素试验等诊断为肺结核。
涂片法和荧光PCR为痰标本。
嘱患者留取晨痰2～5ml（结核患者需停抗结核药3d）。
结核抗体检测则采静脉血2ml。
1.2方法1.2.1涂片染色镜检是临床常用的简易快速的检查方法：取痰或其他已外理好的标本0.1ml，于载玻片上均匀涂抹成2cm×2.5cm椭圆形范围，以自然干燥和火焰固定后，进行抗酸染色，采用珠海贝索生物技术有限公司的结核染色液。
染色步骤：①石碳酸复红溶液染色20min；②5%盐酸酒精脱色3min；③亚甲基蓝溶液染色30S。
结核病实验室题库
上，又对任意一种氟喹诺酮 链霉素
类药物以及下列（ ）中的
至少一种耐药。
45
医疗卫生机构预防感染环境 控制的措施包括（ ）
自然通风
46 结 核 病 感 染预 防控 制的 管理 开展机构肺结核
措施包括（ ）
感染危险性评估
47
常 ）
用
的
通
风
方
式
有
哪
些
？
（
自然通风
48
实验室生物安全包括哪几方 面？（ ）
实验室环境安全
49
萋-尼氏染色抗
萋-尼氏染色法镜检结果，分 级报告标准有（ ）
酸杆菌阴性连续 观 察 300 个 不 同 视野未发现抗酸
杆菌
50
涂片染色镜检制备叙述不准 一张载玻片只能
确（ ）
涂抹一份痰标本
51
抗酸染色痰检假阳性结果的 预防措施正确（ ）
制备玻片时标本 涂抹均匀，不要 太厚或太薄
52
具备以下任何一项症状为肺 结核可疑症状者（）
试验包括(___)
（ PNB ） 生 长 试
验
80 结 核 分 枝 杆菌 比例 法药 敏试 异烟肼
验培养基的配制中哪些药物
应该冷冻保存？(___)
81 结 核 分 枝 杆菌 比例 法药 敏试
验培养基的配制中哪些药物 链霉素 应该冷藏保存？(___)
82
只用灭菌蒸馏水就可溶解的 培养基药物有哪些？(___)
109
关于涂片实验室基本要求正 确的是(___)
在实验室门口处 应设挂衣装置， 个人服装与实验 室工作服分开放 置
110
用于分枝杆菌培养的尿标本 采集应注意(___)
采集标本前，应 清洗外生殖器
结核分枝杆菌分子生物学检测技术介绍
2
交叉引物设计
5’
置换引物
3’ 5’
交叉引物 1
交叉引物 2
5’ 3’
置换引物 5’
BST DNA 聚合酶 具有链置换功能
全封闭式核酸扩增产物快速检测装置
免疫层析显色法技术：核酸检测试纸条包被上特异性的核酸纳米级胶体金颗粒和特 别标记的核酸探针，使扩增后的检测产物和胶体金颗粒结合，在试纸条的检测线 （T线）上显色来检测DNA扩增产物；如果无目标DNA，特异性探针则将无法把扩 增产物与标记物连接，结果无显色。
广州迪澳LAMP
三种LAMP检测试剂盒比较
荣研
华峰
迪澳
样品前处理及 简易装置进行痰标本 手工痰标本液化处理，手工痰标本液化处理，
核酸提取
前处理及核酸提取 煮沸法提取核酸
煮沸法提取核酸
反应温度/时间
67℃/40min
65℃/60min
63℃/30min
操作流程
装置提取核酸后直接 加入到反应管进行扩 增反应。
分子生物学检测技术主要分类
PCR技术：通过控制温度的变化来实现DNA扩增，包括模板变性 （95℃）、 引物杂交（58℃）和DNA合成（72℃） 。
恒温扩增检测技术： DNA在60 ～ 65℃处于动态平衡状态，任何一个引物 向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单 链。
闭扩增产物。
产物。
产物。
是
否
是
交叉引物恒温扩增检测（CPA）
模板序列和交叉引物设计
生物素标记探针
5’AGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATG3’
1150817803结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书
结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒(PCR-荧光法) 说明书【产品名称】通 用 名 称：结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)【包装规格】32人份/盒【预期用途】本试剂盒用于定性检测患者痰液中结核分枝杆菌核酸,可作为临床结核分枝杆菌检测的辅助手段。
适应症：由结核分枝杆菌感染引起的肺结核、肠结核、结核性腹膜炎等疾病。
【检验原理】本试剂盒选用结核分枝杆菌保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Tap酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，既能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对结核分枝杆菌核酸的自动化检测。
【主要组成成份】组成 组成成分 规格核酸提取液 含0.5％Triton-100、5％Chelex-100 1.8mL×1TB反应混合液 含Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP、引物、荧光探针 1.2mL×1Taq酶含TapDNA酶及抗体 14μL×1阳性对照品 主要成分为含TB基因组DNA（重组克隆）人工构建的质粒100μL×1阴性对照品 主要成分为TE Buffer 100μL×1注：不同批号试剂盒中各组份不可以互换。
【储存条件及有效期】试剂-20℃可保存12个月，未使用完的试剂继续冷冻保存不影响其稳定性，但试剂反复冻融不得超过三次。
【适用仪器】具有FAM荧光通道的ABI 7300 、ABI 7500 荧光PCR扩增仪。
【样本要求】1.标本：人痰液。
2. 采集：将患者用力咳出肺深部的痰液采集于无菌样本保存管，密闭送检。
采集具体方法请参考《微生物标本采集手册》一书。
3. 存放：2-8℃保存，不超过24小时；-20℃下保存，不超过3个月；-70℃下长期保存，但应避免反复冻融。
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100菌条/ml
全自动、同时检测利福 67℃恒温扩增，扩增
平耐药基因、特异性高，时间短，特异性高，生
生物安全性高
物安全性高
2.5小时
1000～10000菌条/ml
适合大批量筛查，低费 用
最多一次同时检测八个 标本用量较少，除痰标 假阳性，易污染，需专
样本
本以外的标本需进一步 业人员操作
认证
样本类型（一）
IFN-γ释放试验（T-SPOT.TB）： 肝素锂或肝素钠抗凝血
标本留取标准
1.痰标本：
（1）可疑肺结核患者：初诊病人应收集3份标本（当日 即时、夜间和次日晨痰），治疗中或随访病人应按期留 取2份痰标本（晨痰、夜间痰），体积3～5ml，盛于广口 和具有螺旋盖子的痰瓶中。
耐药结核 ✓当患者具有耐药结核的风险，或者合并HIV感染，或者病情严重 时，应使用Xpert MTB/RIF做初始诊断；
肺外结核 ✓所有患者，包括儿童，怀疑有肺外结核时，应当采集相应的样本 进行微生物学和组织学检查；优先推荐使用Xpert MTB/RIF 做初 始诊断
GeneXpert
Xpert MTB/RIF
实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的办法。
目的基因片段 方法
时间 检测敏感度 优点
缺点
Xpert MTB/RIF
rpoB 半巢式实时荧光PCR
TB-LAMP
gryB及IS6110 环介导恒温扩增
结核杆菌DNA
IS6110 实时荧光定量PCR
2小时
1小时
131菌条/ml
▪ INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的患者，无 论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1。
▪ 约9Байду номын сангаас%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。
1. Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831.
2. Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.
常用技术
传统实时荧光定量PCR检测 半巢式全自动实时荧光定量PCR检测 环介导等温扩增检测 实时荧光核酸恒温扩增检测 交叉引物恒温扩增检测 基因探针检测
抗酸染色
1.阳性率30% 2.无法区分TB or NTB
每张检查3-5min或更长时间→阳性率低因素之一
1.假阳性率高 2.结合抗酸染色
荧光染色
结核菌需要先培养出来（2-6周） 再加入不同浓度抗菌药物的培养基中继续培养4-8周报告药敏结果
2014年WHO关于结核诊断的标准
肺结核 ✓所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做 涂片镜检 或 1份痰做Xpert MTB/RIF检测 ✓对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用Xpert MTB/RIF 或培养 进行 诊断
结核分枝杆菌核酸检测
增加分子生物学阳性可以作为确诊标
准，及强调病原学检查的重要性。
3.4.2 分子生物学检查 结核分枝杆菌核酸检测阳性。 4 诊断原则 肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学、 分子生物学）检查为主，结合流行病史、 临床表现、胸部影像、相关的辅助检查 及鉴别诊断等，进行综合分析做出诊断。 以病原学、病理学结果作为确诊依据。 5.3 确诊病例 结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影 像学检查支持即可确诊。
标本自动 清洗过滤
超声裂解 DNA提纯
DNA和PCR反应 试剂混合
半巢式实时荧光 定量核酸扩增检
测
打印检 测报告
将反应盒放入检测模块 （手工操作完成）
获得检测结果时间：1小时50分钟
MTB/RIF检测对MDR-TB的防控
“结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最 为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限。
结核分枝杆菌核酸及 血清学检测
唐媛媛 潍坊市第二人民医院 检验科
结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异的核酸 序列；
阳性结果提示该检测结核分枝杆菌核酸的存在，在排除 核酸污染的情况下，可确定该检测标本中存在结核分枝 杆菌。
结核分枝杆菌核酸检测较常采用的目的片段有16SrRNA、 IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等
一种半巢式实时荧光PCR体外诊 断技术，可以检测结核分枝杆菌以 及利福平耐药性；
针对rpoB基因81bp利福平耐药 核心区间（RRDR）设计引物、探针 。5个探针结合到野生型，而不是突 变体目标。每个探针用不同的荧光 染料标记，允许同时检测。
痰标本与处理液 1：2混合
吸取2ml处理样品 到反应盒
系统内自动完成
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本、血液（GeneXpert除外）、病理切 片
样本类型（二）
分枝杆菌菌种鉴定 临床分枝杆菌分离培养物
结核分枝杆菌药物敏感性试验： 临床分离结核杆菌纯培养物
结核抗体的检测： 血清
环介导等温扩增仪（TB-LAMP）
体外定性检测结核分枝杆菌复合群； 在恒温条件下进行基因扩增反应； 4种引物识别6个区域，特异性高； 扩增反应效率高，67℃，40min。 主要优点在于对实验室仪器的依赖程度较 小，而且试剂成本较低。
传统实时荧光定量PCR检测
目的：定量检测人标本中的结核分枝杆菌核酸 原理：PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计
抗酸杆菌涂片镜检：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本
分枝杆菌分离培养：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本、血液
结核分枝杆菌的核酸检测：