大肠杆菌感受态细胞制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的1.了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点;2.质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法.二、实验原理外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增，而大肠杆菌转化实验的技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些特殊方法（如点击法，CaCl2处理）处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态细胞。
CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温，低渗（0℃0.1mol/LCaCl2）的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外来的DNA可形成抗DNase的羟基--钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短暂热冲击处理，促使DNA复合物进入细胞，从而实现外源基因的转化。
三、实验材料（一）样品1.连接了目的基因的重组体分子2.细菌——大肠杆菌DH5α菌株：R （限制酶缺陷型），M（甲基化修饰缺陷型），Amp。
（二）试剂1.LB固体和液体培养基（营养培养基）和含Amp的LB固体培养基（选择培养基）；2.氯化钙溶液（1）0.01mol/Lcacl2溶液：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml水中，定容至100ml，高压灭菌后备用。
（2）保存液（含15%甘油的0.01mol/Lcacl2）：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml 水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌后备用。
3.氨苄青霉素（Amp）母液配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
（三）仪器及器材①超净工作台；②恒温摇床；③离心机；④V-1100分光光度计；⑤水浴锅；⑥微量移液器。
四、实验步骤（一）操作步骤1.感受态细胞的制备和保存感受态细胞的制备试验步骤步骤操作（1）细菌小量培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃180r/min震荡培养过夜（2）扩大培养取细菌悬液1ml，以1:100的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃震荡培养1-2h至A600=0.5左右（3）收集菌体将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后4℃5000r/min离心10min，弃上清（4）cacl2处理菌体加入1/10体积（10ml）0-4℃预冷的无菌cacl2（0.01mol/L）溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置10min后，4℃5000r/min离心10min，弃上清（5）感受态细胞的手机与分装加入2000ul预冷的无菌cacl2e(0.01mol/L)重新悬浮细胞，分装成100ul备用（6）长期保存加入1600ul预冷的无菌cacl2(0.01mol/L)和400ul无菌的70%甘油轻轻悬浮细胞或直接加保存液200ml，冰上放置几分钟后，分装成100ul小份，液氮速冻10min后，-70℃保存备用2.转化DNA转化实验步骤步骤操作（1）冰浴取100ul感受态细胞悬液，在冰浴中加入10ul连接产物（或质粒DNA）（含量不超过50mg，体积不超过10ul），轻轻混匀，冰上静置30min（2）热击转化产物在42℃水浴中热击90s（勿摇动，勿超时），之后迅速置于冰上冷却2min（3）复苏向管中加入1mlLB液体培养基，37℃，100-180r/min震荡培养45min至菌液肉眼观察到轻微浑浊（4）涂板，培养取上述菌液100ul涂板，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h（二）注意事项1.细胞的生长状态和密度。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞制备和转化
DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于
细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收
DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温
一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如
卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物
涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，
即可获得细菌菌落。
④ 涂平板: 将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含
Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基
吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
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分 子实
1
生验
0
物
学
注意：
1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入 Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到 平板；
细胞膜的通透性发生暂时性改变, 成为能允许外源 DNA
分子进入的细胞, 称感受态细胞。
2
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1
0
分 子实 生验
物 学
转化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
2
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实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一.实验原理
1.概念 感受态细胞
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后,
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
大肠杆菌感受态细胞的制备（钙转）及转化
2 大肠杆菌感受态细胞的制备（钙转）及转化细菌处于容易吸收外源DNA的生理状态被称之为感受态，一般认为处于感受态的细胞，其细胞膜的通透性增加，易于接受外源的DNA。
质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入感受态细胞的过程通常被称之为转化。
用于一般转化的感受态细胞应该是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配，这样能确保转入的DNA能够稳定复制，所携带的基因能顺利表达。
钙离子介导的大肠杆菌的质粒转化主要基于：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，丢失部分膜蛋白,细胞膜通透性增加；钙离子同添加进来用于转化的质粒DNA形成不易被DNA 酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物容易粘附于细菌细胞表面，以增加进入细胞的几率；42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
进行转化操作的感受态细胞加入非选择性的液体培养基，在最适合生长温度（37℃）进行孵育和复苏，使得转入感受态细胞的外源DNA所携带的筛选标记等基因表达，以获得新的表型（如Amp抗性）；最后将复苏后的大肠杆菌涂布在筛选培养基固体平板上进行筛选即可。
钙离子的处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。
感受态细胞制备及转化影响的主要因素：（1）细胞的生长状态和密度。
最好从－70℃或－20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的培养物，而不要用已经多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳，即应用对数期或对数生长前期的细菌。
菌体密度可通过测定培养液的OD600进行粗略的评价。
对大肠杆菌TG1菌株，OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法一、本文概述随着生物技术的快速发展，大肠杆菌作为常用的基因工程受体菌，其感受态细胞的制备及转化方法对于基因克隆、表达以及基因功能研究等领域具有至关重要的意义。
传统的感受态细胞制备及转化方法往往存在转化效率低、细胞活性不稳定等问题，优化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法成为当前研究的热点。
本文旨在介绍一种经过优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法，旨在提高转化效率，保证细胞活性，并简化操作步骤，为相关领域的研究提供更为可靠、高效的实验手段。
二、材料与方法1 大肠杆菌菌株：选用的大肠杆菌菌株应具备易于转化、生长迅速且遗传背景清晰的特性。
（1）从LB平板上挑取单菌落，接种至5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。
（2）次日，按1:100的比例将菌液转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4-6。
（3）将菌液冰浴10分钟，然后4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体。
（4）弃去上清液，用预冷的1M CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30分钟。
（5）再次4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体，并用预冷的含15%甘油的1M CaCl₂溶液重悬菌体。
（6）将感受态细胞分装至无菌的EP管中，每管50μl，液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。
（2）向感受态细胞中加入适量的质粒DNA（或连接产物），轻轻混匀，冰浴30分钟。
（4）向EP管中加入500μl LB液体培养基，37℃、200rpm摇床复苏45分钟。
（5）将复苏后的菌液涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置培养过夜。
为了提高转化效率，我们在传统的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法上进行了以下优化：（1）在菌液OD600达到4-6时进行感受态细胞的制备，此时菌体处于对数生长期，活性较高，有利于后续的转化。
（2）在制备感受态细胞时，使用预冷的1M CaCl₂溶液进行重悬，并在其中加入15%的甘油，以提高细胞的稳定性并防止冰晶形成。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
E.coli DH5a
37℃振荡
2mL LB 过夜
菌液
1mL
100mlLB
37℃振荡 2-3hrs
菌液
无菌 预冷
弃上清 4℃,4100r/min 收集细胞
10min
冰浴 10min
50mL聚丙烯管
倒
mL 1min
置 30
0.1M CaCl2
重复2次
2ml 预冷 0.1M CaCl2
重悬细胞
悬浮细胞
200ul 1.5mlEP
分装
800μl ＬＢ ４２℃,９０s 水浴 １０μl 40ng DNA 转化
冰浴２min
混匀、冰浴３０min
３７℃ ４５min
涂平板(Ampr)３７℃,１２～１６hrs 观察结果
冻存-70℃
2 转化
实验目的及背景 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因
的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含 重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在 生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目 的基因的产物，这是PCR体外扩增DNA所不能 替代的。配合DNA重组技术，所获得的，不同 目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生 产和生物发酵等领域。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组 子导入细菌的过程。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基— 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌 放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使 在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到 表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉 素的选择性培养基上。
三、实验步骤
1．从大肠杆菌DH5α 的平板上挑取一个单菌落接于
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化ppt课件
实验步骤
➢ 菌株活化 ➢ 感受态细胞制备 ➢ 外源DNA的转化
15
实验步骤
菌株活化
1. 用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培 养基平板表面划线，于37℃培养16小时
2. 挑取一个单菌落，转到3－5ml LB培养基中，于 37℃培养3－5小时
3. 将培养液全部转到100ml LB培养基中培养2－3 小时，到OD600＝0.3－0.4
16
实验步骤
感受态细胞制备
4. 将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5. 4000rpm离心5min,弃上清 6. 加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min 7. 4000rpm离心5 min,弃上清 8. 加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的 受体细胞( Transformant )。
5
实验原理
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有 抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受 体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。 将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在 含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体 才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨 苄青霉素的能力而死亡。
统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化
子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化 频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总 体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子 总数／质粒DNA加入量(mg)
实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
02
在实验过程中，发现感受态细胞的质量和转化效率受到多种因素的影响，如试 剂浓度、温度、时间等。因此，需要严格控制实验条件，确保实验结果的可靠 性和可重复性。
03
实验中还发现，不同批次的大肠杆菌菌株对感受态细胞制备和转化的影响也较 大，这可能与菌株的遗传背景和生理状态有关。因此，在实验中应尽量使用同 一种菌株，以保证结果的稳定性。
序列分析
对转化子进行序列分析，进一步验证目的基 因的准确性。
05
结果与数据分析
转化效率的计算
转化效率计算公式
转化效率 = (转化子数量 / 菌落总数) × 转化体系中 DNA的总量。
转化效率的影响因素
感受态细胞的制备方法、DNA的质量和浓度、转化条 件等。
转化效率的优化
通过调整感受态细胞制备方法和优化转化条件，可以 提高转化效率。
实验材料与试剂
实验材料：大肠杆菌菌株
大肠杆菌菌株
用于制备感受态细胞和转化实验的基本材料，应选择生长旺 盛、纯度高的菌株。
注意事项
确保菌株无污染，并按照实验室规定进行菌株保存和使用。
试剂：CaCl2、LB培养基、Amp等
CaCl2
用于制备感受态细胞的试剂，能够提高大肠 杆菌的转化效率。
LB培养基
用于培养大肠杆菌的生长，提供必要的营养 物质。
02
实验过程中，通过调整试剂浓度、温度和时间等参数，优化了感受态 细胞的制备和转化条件。
03
成功将外源DNA导入感受态细胞，并通过抗生素筛选获得了转化子。
04
实验结果表明，感受态细胞的制备和转化是实现基因克隆和表达的关 键步骤，为后续的分子生物学实验奠定了基础。
结果分析与讨论
01
实验结果与预期基本一致，成功实现了大肠杆菌感受态细胞的制备和转化。
第一章 1-4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.
1第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、基本知识核酸不能自己进入细菌,而是需要帮助,并对细菌经过处理,才能穿过细胞的内、外膜进入,在里边表达和复制。
☺感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Competent cells 。
☺转化(Transformation :是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
2二、大肠杆菌感受态细胞的制备常用CaCl 2成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 产生5×106~2×l07个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的需要。
适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。
制备的感受态细胞可贮存于-70℃,数月至1年。
但保存时间过长会使转化效率受到影响。
新鲜细胞4 ℃保存可用5天。
用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓冲液或水洗细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。
(具体操作及参数,参考仪器说明3☺下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的:–转化缓冲液中试剂的纯度–细胞的生长状态–玻璃和塑料器皿的清洁度4例:Cacl 2法制备感受态细胞(化学法步骤:1从于37℃培养16~20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm ,转到一个含有100ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约3小时。
为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml ,可每隔20~30分钟测量OD 600值来监测培养物的生长情况。
2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。
3于4 ℃,离心10分钟,以回收细胞。
4倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
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大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）
细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：
E. coli DH5α菌株
LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等
培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等
3实验步骤：
1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。
9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。
4注意事项：
1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于10 8个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。
为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并将各稀释维度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞散，从而使分光光度计读数得到标准化。
3. 对大多数大肠杆菌（MC106除外），采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的结果。
Dagert和Ehrlieh的实验(1979)曾表明，细胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h，在贮存的最初12-24 h内，转化率增加4-6倍，然后降低到初始水平。
4. 克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板。
5. 菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α为0.4，要尽量保证OD 值不要过高，更不能超过0.6。
6. 低温处理的时间，做完后冰上保存12-24 h后分装，并保存于-80℃。
7. 试剂和用品，所有的用品（离心管、药瓶等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl2溶液。
转化（热击法）
大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：
质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：
质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：
无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：
（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.
（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
（8）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
（9）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
（10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。
注意白色菌斑。