慢病毒过表达包装步骤

慢病毒（过表达）包装步骤

秦超

1. 转染

复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm 培养皿为例）

⑴最好在铺细胞后20h 左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml ）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。⑵加psin

10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug 于800ul opti-mem ，混匀

⑶加40ul 慢病毒转染试剂于800ul opti-mem ，混匀，室温静置5min ⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min

⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2. 收毒（36-48h）

收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。

⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm 离心管中，然后2000rpm 离心10min ，以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um 滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm 离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80C冻存。由于反复冻融会

降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3. 接毒

接毒前12-20h 铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50% ，务必使用生长状态良好的细胞。

将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene 使其终浓度为8ug/ml

细胞密度60%-70% 时可以再接毒一次。

4. 检测及培养细胞系（48h）

如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin 杀三天（对照

组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。