酪蛋白等电点实验

（二）分光光度法的原理
• Lambert（朗勃）定律
C
L 液层厚度
入射光强度 I0
I
透过光强度
I 透光率 T I0
Io lg k l I
• Beer（比尔）定律
入射光强度 I0 C
L 液层厚度
I
透过光强度
Io lg k c I
• Lambert-Beer（朗勃-比尔）定律
Io lg k l I
• 3、实验前要认真预习，掌握实验的目的、 原理，熟悉操作步骤。听从老师的安排， 不违规操作，注意自身安全。实验完成后 要及时书写实验报告（实验名称、日期、 目的、原理、步骤、结果、结果分析、思 考题，文字简练、准确、认真，实验报告 下一次实验课开始前上交，统一用实验报 告纸）。 • 4、实验台面应随时保持整洁，仪器、药品 摆放整齐。公用试剂用完后，应及时复原。 实验完成后，仪器洗净并放回原处，将实 验产生的垃圾打扫干净，方可离开实验室。
浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得 到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以 后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸
光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。
A
对末知浓度物质测 定时，无需再作标 0.8 准管，据测定管吸 光度从标准曲线上 即可求得测定物的 0.4 浓度。
A k c l
（三）如何求被测组分的含量 1、利用标准管计算测定物的含量 2、利用标准曲线计算测定物含量 3、利用标准系数法求出待测溶液的浓度 4、利用消光系数法求出待测溶液的浓度
（1）利用标准管计算测定物的含量
在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同
时也测定末知浓度（CU）的吸光度（AU），
硒光电池 光电管 光电倍增管
将光信号转变为 电信号的装置。
记录装置： 讯号处理和显 示系统。
分光光度计使用的注意事项
• 比色杯应相匹配性（对光的吸收和反射应一致），不 得随意挪用。 • 比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。 • 盛液时达到比色杯的3/4即可，不能太满，外壁如有液 体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 • 测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后 方可倒掉。
（三）实验材料
• 器材：200和1000μL可调移液枪、试管、试管架、
刻度吸管等 • 试剂：1.00mol/L、0.01mol/L和0.100mol/L乙酸 5g/L的酪蛋白-醋酸钠溶液
（四）操作步骤
-
1.60
混匀后，试管架上静止20min，观察各试管的混 浊情况或沉淀情况，并记录。
（五）注意事项 （1）取样须准确 （2）加酪蛋白-乙酸溶液时，必须加一管，摇匀一管 （六）思考题
（1）为什么上清最清、沉淀最多管的pH值就是酪蛋
白的等电点？ （2）是否还有其它测定蛋白质等电点的方法？简述
其原理。
根据定律得 ：Au KuCuLu 因为：Ku Ks Au Cu 即 As Cs Au Cu Cs As Lu Ls
As KsCsLs
所以As与Au之比值也等于两浓度之 比值
（2）利用标准曲线计算测定物含量
先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它
们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的
• 3、溶液的混匀、过滤及离心
• （1）混匀的目的：使反应体系内的各种物质分子很好的 相互接触，充分的进行反应；使欲稀释的溶液成为浓度均 一的溶液。 • （2）常用的混匀方式 ：腕混匀、指弹混匀、吹吸混匀、 搅拌混匀、磁搅拌混匀、涡旋器混匀等。 • （3）混匀注意事项：防止液体溅出，严禁用手指堵塞容 器口。 • （4）过滤：收集滤液、沉淀或洗涤沉淀。
• 2、自动移液器的使用
优点：使用方便，取、加样速度 快，计量准确，不易破损，可以 吸取多种液体（只需要换枪嘴即 可）
移液器使用方法和注意事项
• （1）设定移液体积： 从大量程调节至小量程为正常调节 方法；从小量程调节至大量程时，应先调至超过设定体积 刻度，再回调至设定体积，这样可以保证移液器的精确度。 • （2）装配移液枪头 ：将移液枪垂直插入吸头，左右旋转 半圈，上紧即可。 • （3）吸液及放液： 垂直吸液；吸头尖端浸入液面3mm以 下，吸液前枪头先在液体中预润洗2-3次确保移液的精度 和准 ； 慢吸慢放，以防突然松开溶液吸入过快而冲入取 液器内腐蚀柱塞而造成漏气；放液时如果量很小则应吸头 尖端可靠容器内壁。 • （4）不适合吸取浓度和粘度大的液体（可采用反向移液 技术移取高粘度液体） 。 • （5）吸有液体的移液枪不应平放，枪头内的液体很容易 污染枪内部而可能导致枪的弹簧生锈。
当溶液pH值达到某一值时，蛋白质分子成为所带的正
、负电荷数相等的兼性离子，此时溶液的pH值就是该 蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质的粘度和溶解 度均大幅降低。
本实验观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解状态以测 定其等电点。以醋酸和酪蛋白溶液中的醋酸钠构成各种不 同pH值的缓冲液，在某种溶液中，酪蛋白溶解度最小时， 该溶液的pH值就是酪蛋白的等电点。
• 5、注意节约药品、试剂；洗涤和使用仪器 时要小心仔细，防止损伤仪器及造成自身 伤害；发现仪器故障应立即报告老师，不 可擅自动手检修。 • 6、严禁在实验室吸烟、喝水、吃东西。 • 7、每次实验课结束，由班长负责安排值日 生，负责打扫实验室卫生。
二、生物化学实验的基本操作
• （一）常用玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿洁净与否，是实验结果是否准确的重要环 节。洁净依据：内壁应十分明亮光滑，无水珠附在 玻壁上。 1、新购玻璃器材的清洗：一般用1~2%的稀盐酸浸 泡1~2h，有条件的可以用浓硫酸浸泡30min，再用水 冲洗，以去除附着的油污、灰尘和金属离子等。 2、用过的玻璃器材清洗： （1）一般器皿（如烧杯、试管等） 用肥皂水和毛 刷刷洗，再用清水冲洗干净。
0.2 C ● 0.6
●
标准曲线（浓度-吸光度曲线）
（四）分光光度计的基本结构
光源
单色 光器 棱镜 衍射光栅
吸收池
检测器
显示
钨丝灯
可见光源 350~1000nm
玻璃比色杯 石英比色杯
玻璃——能吸收UV 光，仅适用于可见 光区。 石英——不能吸收 紫外光，适用于紫 外光区。
氢灯 氘灯
紫外光源 200~360nm
三、分光光度法
• （一）分光光度法的原理（掌握）
• （二）如何求被测组分的含量（掌握）
• （三）分光光度计的基本结构
• （四）分光光度法计的使用与注意事项
（一）分光光度法
• 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴 别物质或测定其含量的一项技术。 • 特点：灵敏度高（可达10-5~10-6mol/L ）、 精确度高（误差<5%）、操作简便、快速。 对于复杂的组分系统，无须分离即可检测 出其中所含的微量组分。
生物化学实验基本技能
病原菌多基因调控机制研究
内容提要
• 一、生物化学实验要求与实验室规则 • 二、生物化学实验的基本操作 • 三、分光光度法
一、生物化学实验要求与实验室规则
• 1、遵守课堂纪律、维护课堂秩序，不迟到、 不早退，严禁打闹，进入实验室必须穿实 验服。 • 2、原则上不允许请假。如是病假，须医院 开具证明，且要辅导员签字；如是事假， 列出事假理由，并有辅导员签字。由于请 假漏做的实验，需要补做，否则零分。无 故旷课，则零分，且实验课须重修。
公式的意义： 当I I0时， lg 当I＜I0时，lg
＋
Io lg k c I
＝
Io lg k c l I
I0 0，表示溶液完全不吸收光线； I
I0 值大，表示溶液吸收光线较多； I I 当I 0时，lg 0 值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收，即溶液不透光。 I I 由此可见， lg 0 表示溶液对光吸收的程度，称作吸光度（absorbance）， I I 用A表示，即A lg 0 I
（2）定容分析器皿（如吸量管、量筒等） 比较干 净的，直接去离子水冲洗即可；否则用铬酸（酸性 和氧化性）洗液浸泡，自来水和蒸馏水冲洗。
（3）粘附有血浆的刻度吸管清洗 45%尿素浸泡或 1%氨水浸泡后，再稀盐酸浸泡，对于顽固污垢可再 次采用重铬酸钾溶液浸泡。
• （二）常用器材的使用方法 1、吸量管种类和使用 （1）种类：移液管、奥氏吸管和刻度吸管
• （6）移液枪在每次实验后应将刻度调至最大，让弹簧回 复原型以延长移液枪的使用寿命 • （7）移液枪校正 ：可用分析天平称量所取纯水的重量并 进行计算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20℃时重 0.9982g. • （8）移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如 浓酸、浓碱、有机物等）。 • （9）严禁使用移液器吹打混匀液体。 • （10）不要用大量程的移液器移取小体积的液体，以免影 响准确度； 同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液 体，请使用移液管进行操作。 • （11）如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物；定期 清洁移液枪外壁，可以用95%酒精或60%的异丙醇，再用 蒸馏水擦拭，自然晾干。
移液管
奥氏吸管 刻度吸管
• （2）刻度吸管的使用 • 使用前：① 吸管无破损且干净；②选取合适的量 程；③观察有无“吹”字：若有，说明刻度到尖端， 放液后需将尖端的溶液吹出，否则不吹。 • 握法：拇指和中指夹拄吸管，食指游离。 • 取液：①垂直入液 ，且入液深度适中；② 吸耳球 吸取液体，并使液高高于待量刻度2-3cm； ③ 食 指按紧吸管上端，并提离液面、观察液内有无气泡。 • 放液至刻度：刻度吸管垂直，右眼与刻度线平行， 轻轻松开食指（转动刻度吸管），使液面缓慢降低， 直至最低点与刻度线相切。 • 放液至容器：刻度吸管垂直，容器倾斜45℃，使溶 液自然流入容器，注意吹与不吹。 • 注意：一根吸管只吸取一种试剂；严禁用嘴吸。
实验一
病原菌多基因调控机制研究
酪蛋白等电点测定 （P62）
实验目的
• 通过实验进一步了解蛋白质的理化性质
• 理解等电点的意义及蛋白质在等电点时的性质
• 熟悉蛋白质等电点测定的操作方法
wenku.baidu.com验原理
• 蛋白质是两性电解质，分子中含有的氨基和羧基均可
电离。当溶液中的pH值大于等电点时，其氨基电离被 抑制而羧基电离，蛋白质成带负电荷的阴离子。反之 ，当溶液pH小于蛋白质等电点时，其羧基电离受到抑 制而氨基接受质子，蛋白质成为带正电荷的阳离子。