实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳

实验五核酸琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm（紫外透射仪）激发。

三、材料、仪器和试剂

1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA

2、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统

3、试剂

（1）50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 37.2g，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。

（2）6×电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。

（3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL。用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。

（4）分子量标准DNA：DNA Marker

四、操作步骤

1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml)：称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。

注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的

2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。在冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料（10ml:1ul），混匀后小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止。

注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。

倒胶时，不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。

3、加样：在点样板或EP管中混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染。加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序)。

注意：加样时，要把枪头插入到加样孔里，但是不要插穿加样孔底部凝胶，保证样品尽量在加样孔中而不外溢。

4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

5、电泳完毕后，取出凝胶

6、观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

注意事项：

1、操作时带一次性手套，避免DNA酶污染引起DNA降解。

2、及时更换电泳缓冲液，电泳缓冲液在电泳槽中存放过，多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。

3、一般情况，电泳电压<20V/cm，温度<30℃；大分子量DNA链电泳，温度应<15℃。

4、电泳前样品勿受热，以免引起DNA变性。

5、凝胶中DNA的上量要合适，太多会引起DNA条带模糊，太少又会引起条带信号弱或无DNA条带。

思考题

1、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

2、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？