亲和与印迹分离技术
分子识别技术的研究及其应用
分子识别技术的研究及其应用在现实生活中，我们经常需要对各种不同的分子进行识别，例如检测污染物、确定药物分子与受体蛋白的互作等等。
为此，分子识别技术一直是化学研究的重要领域。
本文将介绍目前热门的分子识别技术——分子印迹技术和表面等离子共振（SPR）技术，并探讨它们的应用前景。
一、分子印迹技术1. 原理分子印迹技术是基于化学亲和作用的一种识别技术。
它通过在合适的条件下，将目标分子与功能单体共同反应形成固定相，再将目标分子从固定相中洗脱出来，留下能与目标分子高度亲和、有特定识别性的模板分子，在最后的分析中使用。
这种技术的核心在于“印迹”，即将目标分子与功能单体结合，形成一种高度特异的固定相。
此时，功能单体能够和目标分子发生非共价键作用，比如氢键、离子键、范德华力等等。
而对于其他分子，则几乎不能与功能单体发生这些非共价键作用。
在提取目标分子后，留下的模板分子可以重复识别目标分子。
2. 应用分子印迹技术主要应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。
例如：（1）分离分析：利用印迹技术可以实现对生物样品中特定分子的快速富集和分离，从而便于后续的分析。
（2）药物研究：印迹技术可以用来筛选与靶分子有高度亲和力的化合物，从而帮助药物研究中的药物设计和优化。
（3）环境监测：印迹技术可以对水、大气、土壤等环境样品中的污染物进行检测和分析。
二、表面等离子共振（SPR）技术1. 原理SPR技术是一种广泛应用于表面生物化学和生物医学研究的技术。
它是一种传感技术，通过检测光学信号，实时地测量生物分子之间相互作用的动态变化。
SPR技术的核心是金属薄膜表面上，被称为“感知芯片”的金属分子表面。
当感知芯片与物质相互作用时，物质在感知芯片表面的折射率会发生变化，导致入射光线的反射角发生变化。
利用特殊的光学仪器可以监测到这种变化，从而确定物质与感知芯片之间的相互作用情况。
2. 应用SPR技术主要应用于制药、免疫学、基因组学等领域。
例如：（1）药物筛选：SPR技术可以用来筛选药物分子和受体之间的相互作用，从而帮助制药厂家提高药物的研发效率。
环保监测中的分子印迹技术
环保监测中的分子印迹技术近年来，随着环境污染、食品安全等问题的日益凸显，环保监测和食品安全监测成为了社会各界高度关注的话题。
为了更好地保障公众健康和生态环境的安全，科学家们通过不断研究和创新，不断提高监测技术的水平和精准度。
而其中，分子印迹技术无疑是一项具有前途和广阔发展前景的监测技术。
一、分子印迹技术的原理及应用分子印迹技术是一种基于化学反应原理的监测技术，它主要利用聚合物材料的亲和性和选择性来识别和分离目标分子。
简单来说，就是通过特定分子与聚合物发生化学反应，从而选择性地捕获并固定目标分子，在后续过程中实现分离和检测的技术。
分子印迹技术在环保监测领域中的应用主要体现在对水环境和大气环境中的有害物质的检测。
能够利用分子印迹技术检测的污染物称为核心分子，它们可能在水中、大气中或其他环境中出现。
一些常见的核心分子包括重金属离子、有机物、农药残留等。
分子印迹技术通过分子印迹聚合物材料和核心分子的化学反应，选择性地捕获并固定核心分子，实现对环境中有害物质的检测和分离。
二、分子印迹技术与传统监测方法的比较相对于传统监测方法，分子印迹技术具有重要优势。
在水环境污染的监测中，传统的监测方法主要是通过气相色谱法和液相色谱法等手段，对单一污染物进行检测和分析。
而分子印迹技术则是基于分子选择性的检测原理，能够针对多种污染物进行有选择性的检测和分析，且操作低成本、操作简单、检测快速。
除此之外，相较于传统监测方法，分子印迹技术还具有很高的检测灵敏度和准确度。
由于分子印迹聚合物材料具有很高的亲和性，能够非常有效地捕获目标分子，从而增加了检测的准确性。
同时，分子印迹技术能够进行跨学科交叉，将多个优势点进行整合，从而实现更完善的监测。
三、分子印迹技术在食品领域中的应用随着社会经济的不断发展，食品安全问题也被广泛关注。
在这方面，分子印迹技术也被广泛应用于食品安全监测。
例如，在检测食品中的有害物质、添加剂和农药残留等方面，分子印迹技术都已经有了广泛的应用。
10-亲和分离技术
4 亲和吸附介质
商品化的亲和吸附介质
亚胺二乙酸 5
4
天然吸附介质
亲和吸附介质
Home-made亲和吸附介质
如植物凝集素与糖具有亲和结 合作用，因此，天然琼脂糖凝 胶和葡聚糖凝胶可直接用做外 源凝集素的亲和吸附介质。
例如:
1st Sephadex凝胶是葡萄糖通过a1.6结合与交联制备的葡萄糖凝 胶,可亲和吸附伴刀豆球蛋白 A(一种植物凝集素);
基质材料 要求聚合物分子上含有 —-OH、— NH2、—SH、—COOH等。即纤维素、聚酰胺等 的聚合物。
基材活化方法：溴化氰法、双环氧烷法、高碘酸 盐法等。
18
8. 亲和膜分离 亲和膜的间隔臂
在分离相对分子质量很大的生物大分子时，为了克服几 何位阻障碍，往往在介质和配位基之间插入一个具有一 定几何长度的有机基团，即间隔臂（或空间臂），以使 欲分离的物质方便地接近配位基上的亲和位点。
His性质独特: 具有弱疏水性、咪唑环为弱电 性。因此His可与pro发生亲和合作用。在盐浓 度较低的pH约等于目标pro的pI溶液中，固定 化His亲和作用最强，随盐浓度，亲和作用。 因此利用His为配基可分离pI相差较大的pro。
空间位阻
12
6 配基连接
间隔臂
空间位阻：当较小的配基直接固 定在载体下，会由于载体的空 间位阴，配基与生物大分子不 能发生有效的亲和吸附作用。
④ 选用一种能与膜上的亲和配基产生相互作用的试剂10通过 膜或调节体系的pH、离子强度、温度等使形成的配合物解 离而洗脱得到纯化好的物质11，膜上亲和配基则被顶替物 质12占有；
⑤ 选用合适的洗涤试剂洗脱试剂分子12，使膜再生。
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间隔臂分子
膜+ 2
萘普生分子印迹拆分及亲和吸附平衡常数的测定
萘普生分子印迹拆分及亲和吸附平衡常数的测定
雷建都;谭天伟
【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】2002(023)011
【摘要】@@ 分子印迹(Molecular imprinting)是一种新的、很有发展潜力的分离技术[1～3]. 该技术已成功地用于氨基酸、糖类及其衍生物和药物的手性分离. 萘普生是一种重要的非甾体消炎、解热和镇痛药, 为了减少给药量和对人体产生的毒副作用, 必须对其进行手性拆分. Mosbach等[4]曾以4-乙烯基吡啶为功能单体, 利用分子印迹对外消旋萘普生进行了手性拆分, 但4-乙烯基吡啶使用前需经过减压蒸馏, 使用不便. Haginaka等[5～7]也采用4-乙烯基吡啶为功能单体, 以(S)-萘普生为模板制得了均一粒径的分子印迹介质.
【总页数】3页(P2073-2075)
【作者】雷建都;谭天伟
【作者单位】北京化工大学生物化工系,北京100029;北京化工大学生物化工系,北京100029
【正文语种】中文
【中图分类】O657.32
【相关文献】
1.萘普生分子印迹拆分过程热力学研究 [J], 焦飞鹏;黄可龙;于金刚;彭霞辉;赵学辉;宁凤容
2.D-萘普生温敏分子印迹凝胶的制备及吸附性能研究 [J], 李金苓;赵义平;张未来;王霞;陈莉;张青松
3.反射干涉光谱法测定分子印迹敏感膜表面吸附的分子浓度 [J], 刘冬梅;王永向;刘秋明;戎非;付德刚
4.S-布洛芬磁性分子印迹膜的吸附及拆分性能 [J], 徐文慧;袁亚莉;李玉慧;李乐;周智慧;张宗波
5.利用分子印迹聚合物对外消旋药物萘普生的手性拆分 [J], 雷建都;谭天伟
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现代生物分离技术
现代生物分离技术生物分离技术是生物学领域中的一项重要科研技术，主要利用生物体中分子间所存在的电性、磁性、电荷、大小、形状等特性，从而通过各种不同的分离技术来获得所需的分子。
现代生物分离技术可以分为物理分离技术和化学分离技术两大类，其中物理分离技术包括了色谱分离、电泳分离、离心分离、过滤分离等各种技术，而化学分离则主要是利用化学反应或结构差异来实现生物分子的分离。
本文将对现代常用的生物分离技术进行详细说明，讨论其原理、特点及应用。
一、色谱分离技术色谱分离技术是基于质量、分子量、分子大小、溶解性、极性或疏水性等特性，将混合物中的物质从复杂的混合物中分离出来的一种分离技术。
色谱分离技术是现代分离技术中应用最广泛的一种技术，其主要原理是利用各种固定相（如气相、液相、固体等）与流动相（如气体、液体、超临界流体等）之间的相互作用来实现生物物质的分离。
主要包括了气相色谱、液相色谱、离子交换色谱、凝胶层析、亲和层析等。
色谱分离技术广泛应用于复杂的生物分子的分离和纯化，如对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离和纯化。
二、电泳分离技术电泳分离技术是利用电场作用力将荷电粒子（如DNA、蛋白质等）从混合物中分离出来的一种分离技术。
其原理是将混合物置于电场中，根据电荷的性质，荷电粒子在电场中产生运动，并在电极上沉淀。
电泳分离技术广泛应用于DNA、RNA、蛋白质等生物分子的分离和定量。
三、离心分离技术离心分离技术是根据生物分子的密度、大小、形状等物理特性将生物分子从混合物中分离出来的一种分离技术。
其主要原理是利用高速旋转的离心机作用，将混合液中的生物分子产生沉降差异，最终通过离心分离技术将生物分子分离出来。
离心分离技术广泛应用于细胞分离、蛋白质纯化、细胞器组分分离、病毒富集等方面。
四、过滤分离技术过滤分离技术是利用精密的过滤器或膜将混合物中的生物分子分离出来的一种分离技术。
其原理是利用过滤膜的孔径选择性来实现分离，对于小的分子可以通过膜的小孔径，而大分子由于尺寸过大而不能穿过膜孔。
蛋白印迹实验方法的原理和步骤 -回复
蛋白印迹实验方法的原理和步骤-回复# 蛋白印迹实验方法的原理和步骤引言蛋白印迹技术是一种分子生物学实验方法，旨在研究蛋白质的结构和相互作用。
它通过特定蛋白质与其配体之间的相互作用，为科学家提供了一种探索生物分子间关系的有力工具。
本文将详细介绍蛋白印迹实验的原理和步骤，帮助读者更好地理解和应用这一技术。
一、蛋白印迹实验的原理蛋白印迹实验基于蛋白质的亲和性。
其核心原理是通过在固相载体上固定待检测蛋白，形成“印迹”；然后，通过加入特定配体或标记分子，探测蛋白质的存在和量化信息。
# 1.1 亲和性基础蛋白印迹实验的亲和性基础建立在生物分子相互吸引的原理上。
通过控制条件，使蛋白质与特定的配体结合，从而在实验中可靠地检测目标蛋白质。
# 1.2 固相载体的选择在蛋白印迹实验中，固相载体的选择是至关重要的。
常用的载体包括聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜等。
载体的选择需根据待检测蛋白的性质和实验目的来确定。
二、蛋白印迹实验的步骤# 2.1 样品准备在进行蛋白印迹实验前，首先需要准备样品。
样品的制备过程包括细胞裂解、蛋白抽提和浓缩等步骤。
确保样品的纯度和完整性对于获得可靠实验结果至关重要。
# 2.2 SDS-PAGE电泳将样品加载到SDS-PAGE凝胶中，通过电泳分离蛋白质。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量将其分开，为后续的印迹步骤提供基础。
# 2.3 转膜将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到固相载体上，通常使用半湿法或湿法转膜。
这一步骤旨在将蛋白质牢固地固定在载体上，为后续的孔隙印迹创造条件。
# 2.4 孔隙印迹孔隙印迹是蛋白印迹实验的关键步骤，通过将蛋白质印在载体上形成“印迹”。
这一步骤通常涉及用于特定蛋白的抗体或配体，以实现对蛋白质的高度选择性识别。
# 2.5 探测与显色加入特定配体或标记抗体，使其与待检测蛋白结合。
通过适当的显色方法，如酶联免疫吸附实验（ELISA）或化学发光，检测蛋白质的存在并量化其含量。
用于复杂生物样品体系分离与识别的分子印迹技术最新进展
用于复杂生物样品体系分离与识别的分子印迹技术最新进展谢宝轩;吕洋;刘震【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2024(42)6【摘要】由生物样品中复杂组分所导致的基质效应会严重影响分离分析技术的准确性、灵敏度与可靠性。
免疫亲和技术作为降低或消除基质效应的方法已被广泛应用于诊断分析和蛋白纯化等领域,但该技术仍存在明显的缺点,如成本高昂、制备流程繁琐、保存条件苛刻以及配体浸出等问题。
目前,如何通过有效降低或消除复杂生物样品中的基质效应来实现痕量目标分析物的分离及识别仍是一个具有挑战性的问题。
分子印迹技术(molecular imprinting technology,MIT)一直被广泛应用于固相萃取与色谱分离等领域,随着MIT的发展,各种新型印迹策略被提出;其中,分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer,MIP)作为一种能够模拟抗原-抗体间相互作用的高分子聚合物,可以从各种复杂生物样品中提取出目标分析物,从而有效消除基质效应的影响。
MIP不仅拥有高特异性与高亲和力的优点,而且与抗体和适配体等生物大分子相比,MIP还具有稳定性高、成本低廉以及制备简便等优势。
近年来一些基于MIT的传统分离技术得到了深入发展,其中包括色谱固定相以及固相萃取吸附剂等。
此外,结合了MIT与高灵敏检测技术的分析方法在疾病诊断和生物成像等领域也受到了广泛关注。
本文着重介绍了近年来发展的新型印迹策略,并介绍了基于MIP的分离分析方法在各领域中的应用以及现阶段存在的不足,最后对MIT的未来发展方向做出了展望。
【总页数】16页(P508-523)【作者】谢宝轩;吕洋;刘震【作者单位】南京大学化学化工学院【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.分子印迹技术在生物大分子分离识别中的应用2.分子印迹技术用于生物大分子的识别3.分子印迹聚合物在手性药物和生物分子识别分离中的应用4.分子印迹技术手性分离氨基酸衍生物(Ⅱ)—流动相对分子印迹聚合物手性拆分效果的影响5.分子印迹技术手性分离氨基酸衍生物(Ⅰ)—分子印迹聚合物的制备、色谱评价及物理化学表征因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫印迹wb的原理
免疫印迹wb的原理免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生命科学研究领域。
它可以用来检测特定蛋白质在复杂的混合物中的存在与表达水平，具有高灵敏度和高特异性的优势。
免疫印迹的原理基于蛋白质的分子量、电荷和亲和性等特性。
首先，需要将待分析的蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳进行分离，将蛋白质按照分子量大小分成不同的带状条带。
然后，将蛋白质从凝胶转移到聚合物膜（通常为聚偏氟乙烯膜）上，这个步骤称为电转移。
电转移过程中，蛋白质会被定向转移到膜上，形成与凝胶上相对应的蛋白质条带。
接下来，进行与待检测蛋白质特异性结合的抗体处理。
将膜浸泡在含有特异性一抗的抗体溶液中，一抗与待检测蛋白质结合形成免疫复合物。
为了增强对抗体-蛋白质复合物的检测灵敏度，通常需要进行洗涤步骤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合的物质。
然后，加入与第一抗体结合的二抗，这个二抗通常是与酶结合的二抗。
这种酶可以与染色底物发生反应，产生明显的信号。
这一步骤被称为二抗结合。
经过洗涤去除未结合的二抗后，加入染色底物，底物与酶发生反应后会生成可见的信号，形成蛋白质检测结果。
这种信号可以通过暗室或者专用的设备进行可视化，并进行定量分析。
免疫印迹技术的优点在于其高度特异性和高灵敏度。
通过使用特异性抗体，可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。
此外，免疫印迹还可以同时检测多个蛋白质，通过在膜上分别施加不同的抗体可以同时检测多个目标蛋白质。
然而，免疫印迹也存在一些限制。
首先，免疫印迹需要特异性抗体来检测目标蛋白质，这对于一些没有合适抗体的蛋白质来说是一个挑战。
其次，免疫印迹需要较长的实验时间，从样品制备到最终结果的获取需要几天时间。
此外，免疫印迹对于蛋白质分子量较大的蛋白质检测效果较差。
总结起来，免疫印迹是一种常用的蛋白质分析技术，通过将蛋白质从凝胶转移到膜上，并使用特异性抗体进行检测，可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。
分子印迹技术
分子印迹技术分子印迹技术是近年来集高分子合成、分子设计、分子识别、仿生生物工程等众多学科优势发展起来的一门边缘学科分支。
基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点。
因此，分子印迹技术在许多领域，如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析等得到日益广泛的研究和开发，有望在生物工程、临床医学、环境监测、食品工业等行业形成产业化规模的应用。
下面就介绍一下分子印迹技术的有关知识。
一、分子印迹技术理论分子印迹技术概念分子印迹技术(molecular imprinting technique, MIP)是指为获得在空间和结合位点上与某一分子(模板分子、印迹分子) 完全匹配的聚合物的实验制备技术。
实现分子印迹技术的步骤分子印迹技术是通过以下方法实现的:(1) 在适当的介质中，具有适当功能基的功能单体通过与模板分子间的相互作用聚集在模板分子周围，形成单体—模板分子复合物。
(2) 选择适当的交联剂，与功能单体在致孔剂的存在下互相交联起来形成聚合物, 从而使功能单体上的功能基在特定的空间取向上固定下来。
(3)通过一定的物理或化学方法把模板分子脱去。
这样就在高分子共聚物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配, 并含有与模板分子专一结合的功能基的三维空穴。
这个三维空穴可以选择性地重新与模板分子结合, 即对模板分子具有专一性识别作用。
分子印迹技术的分类按照单体与模板分子结合方式的不同, 分子印迹技术可分为分子自组装和分子预组织两种基本方法。
分子自组装法(self-assembling)又称非共价法，是由瑞典的Mosbach及其同事在20世纪80年代后期创立的。
在此方法中，模板分子与功能单体之间自组织排列，以非共价键自发形成具有多重作用位点的单体—模板分子复合物, 经交联聚合后这种作用保存下来。
常用的非共价键作用有：氢键、静电引力、疏水作用力、电荷转移、金属配位键以及范德华力等，其中以氢键应用最多。
印迹法
数据处理及结果分析1. PhFra bibliotektoshop 软件
2. Image J 软件 3. Excel 软件 4. Graphpad prism 软件
Western bloting 的应用
• 生物学领域：各种刺激下细胞某种蛋白的表达情 况、粘放菌5519I型菌毛鉴定 • 医学领域：骨折的愈合、肿瘤发生机制、糖尿病 大鼠角膜上皮细胞HIF-1α蛋白表达量及组织工程 骨修复骨缺损的机制等病理生理学研究主要采用 免疫组化的方法 • 其它
转膜后检测
丽春红染色
丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽
春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带，丽春 红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用PBS或TBS-T溶液洗去
封闭
• 脱脂奶粉（5％） • BSA（牛血清白蛋白） • Western Blotting 膜封闭液
western显色的方法主要有以下几种
i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色， 体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表 文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试 剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇 到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
2．培养的细胞（定量）：
⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有 可能使细胞脱落）。 ⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上 10~20min。 ⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后按比例加入 loading-Buffer（含DTT ）,100 ℃ ，10min。 ⑷ 12000g离心，4℃，2min。 ⑸ 取少量上清进行定量。 ⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加 loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于 1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
亲和分离技术
影响因素
2nd 配基浓度对mA作用 图为 OGP 浓度对 con A 分配系数的影响，随着 OGP浓度增大，con A 的分配系数增大
影响因素
3rd 对适应pH范围的作用
图示: 通过添加亲和助表面 活 性 剂 可使目 标 产物 的萃 取pH范围增宽。 意 义 ： 因此利用亲和反胶 团萃取不仅可以提高目标产 物的分配系数 ( 回收率 ), 而 且由于萃取操作的 pH 范围 较宽，便于通过调节 pH 值 提高萃取分离的选择性。
机理:
对于多效价目标分子与配基结合,
1 1 Kd P L PLn n n
P-目标分子，L-配基，PLn-单目标 分子与n配基形成的复合体.
影响因素:
1 配基浓度和亲和分配系数Kd，[L]
or [PEG – L]，[PEG-L]/{[PEG-L] + [PEG]}
2 配基种类
操作过程:
亲和分离技术
More tech…
亲和萃取 亲和沉淀的基本原理和特点 分子印迹分离技术
2、亲和萃取
（ affinity partitioning ）
亲和萃取就是将亲和色谱的亲和配基用于萃取分离。 包括： • 亲和双水相 • 亲和反胶团
2.1 亲和双水相分配
传统的双水相体系 （aqueous two-phase extraction）
3 亲和沉淀 （affinity precipitation）
PEG=聚已二醇(polyethylene glycol) DX = 葡聚糖(dextran)
亲和分配(Affinity partitioning):
利用偶联亲和配基的 PEG 为成相 聚合物进行目标产物的双水相萃 取，可在配基的亲和作用下促进 目标产物在 PEG 相的分配，提高 目标产物的分配系数和选择性。 这就是亲和萃取，又称亲和分配.
中药材提取分离新方法-分子印迹技术
传统方法在分离中药材中的活性成分时，往往难以达到高纯度和高收率的要求。
中药材复杂成分对提取分离的影响
中药材中化学成分复杂，包括多种类型的化 合物，如生物碱、黄酮、皂苷等，这些化合 物的性质差异较大，给提取分离带来困难。
分子识别过程类似于锁钥 模型，印迹聚合物中的空 穴形状、大小和官能团与 模板分子相匹配。
非共价键作用
分子间识别主要依赖于非 共价键作用，如氢键、范 德华力、静电作用等。
印迹聚合物制备方法
共价印迹法
通过共价键将模板分子与功能单体连接，形成共价复合物 ，再与交联剂、引发剂混合聚合。
非共价印迹法
模板分子与功能单体通过非共价键作用自组装形成复合物 ，再加入交联剂、引发剂进行聚合。
中药材提取分离新方法-分子印迹 技术
目录
• 引言 • 分子印迹技术基本原理 • 中药材提取分离现状与挑战 • 分子印迹技术在中药材提取分离中应用 • 实验设计与结果分析 • 结论与展望
01 引言
背景与意义
中药材提取分离的重要性
01
中药材是中医药学的物质基础，其有效成分的提取分离对于中
药现代化和国际化具有重要意义。
分离中的优越性
分子印迹技术优势及局限性讨论
优势
高选择性、高灵敏度、可重复使用、 制备简单等
局限性
模板分子泄露问题、识别位点非均一 性、对复杂体系适应性有待提高等
未来研究方向和应用前景展望
研究方向
开发新型功能单体和交联剂，提高MIP性能；拓展MIP在中 药材质量控制和药效物质基础研究中的应用；探索MIP与其 他分离技术的联用，形成更完善的分离体系
生物化学第五节 生物大分子相互作用研究技术
第五节生物大分子相互作用研究技术2015-07-16 70976 0生物大分子之间可相互作用并形成各种复合物，所有的重要生命活动，包括DNA的复制、转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等，都是由这些复合物所完成。
研究细胞内各种生物大分子的相互作用方式，分析各种蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA复合物的组成和作用方式是理解生命活动基本机制的基础。
有关研究技术发展迅速，本节选择性介绍部分方法的原理和用途。
一、蛋白质相互作用研究技术目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括酵母双杂交、各种亲和分离分析（亲和色谱、免疫共沉淀、标签蛋白沉淀等）、FRET效应分析、噬菌体显示系统筛选等。
本部分简要介绍标签蛋白(tagged protein)沉淀和酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)。
（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。
该方法利用一种带有特定标签( tag)的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与待检测的纯化蛋白或含有此待测蛋白的细胞裂解液温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，洗脱液经电泳分离并染色。
如果两种蛋白有直接的结合，待检测蛋白将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀( pull-down)，在电泳胶中见到相应条带（图20-6）。
图20-6 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图目前最常用的标签是谷胱甘肽S-转移酶( GST)，有各种商品化的载体用于构建GST融合基因，并在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白。
利用GST与还原型谷胱甘肽(glutathione)的结合作用，可以用共价偶联了还原型谷胱甘肽的琼脂糖珠一步纯化GST融合蛋白。
另一个常用的易于用常规亲和色谱方法纯化的标签分子是可以与镍离子琼脂糖珠结合的6个连续排列组氨酸( 6xHis)标签。
标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。
northern印迹法原理
northern印迹法原理Northern印迹法原理引言：Northern印迹法是一种在分子生物学研究中常用的技术，它可以用来检测DNA或RNA序列的特定区域。
本文将重点介绍Northern 印迹法的原理及其在科研中的应用。
一、Northern印迹法的原理Northern印迹法是根据亲和性的原理来实现的。
它利用DNA或RNA的亲和性与亲和剂结合，通过电泳将目标分子分离并转移到膜上，然后用探针与目标分子进行特异性的杂交，最后通过染色或放射性探针的探测来检测目标序列的存在。
1. 样本制备需要从细胞或组织中提取总RNA，并将其转录成cDNA。
这个步骤可以使用反转录酶来完成，反转录酶可将RNA转录成互补的DNA 链。
2. 准备RNA样品接下来，需要将RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，以获取目标RNA序列。
这一步骤是通过将RNA样品与琼脂糖溶液混合后，加热并加载到琼脂糖凝胶槽中进行电泳分离。
3. 转移RNA到膜上分离完成后，需要将RNA从琼脂糖凝胶上转移到膜上。
这一步骤可以通过将膜放置在琼脂糖凝胶上，并应用电流使RNA迁移到膜上。
4. 探针杂交在膜上进行杂交的目的是检测特定的RNA序列。
为了实现这一步骤，需要用探针标记的DNA序列或放射性同位素探针与RNA序列进行杂交反应。
探针的选择应该是与目标序列互补的序列。
5. 探测目标序列在探针杂交反应发生后，需要用染色剂或放射性探针来检测目标序列的存在。
这一步骤可以通过染色或使用放射性探针的放射性测量来完成。
二、Northern印迹法的应用Northern印迹法在分子生物学研究中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 基因表达分析Northern印迹法可以用来研究特定基因的表达水平。
通过检测目标基因的mRNA在不同组织或条件下的表达情况，可以了解该基因在生物体内的功能和调控机制。
2. 疾病诊断与治疗Northern印迹法在疾病的诊断和治疗中也起到了重要的作用。
分子印迹技术在天然产物分离纯化中的应用
分子印迹技术在天然产物分离纯化中的应用
分子印迹技术是一种新兴的化学技术，它能够根据给定的分子构型精确地分离和纯化天然产物，具有优势的可操作性、选择性和杂质的低检测能力等多项优势，极大地拓展了天然产物的分离纯化技术空间。
一、分子印迹技术的原理
分子印迹技术是在可编程的水凝胶中，以吢啶环或其它反应型发生器作为印迹分子，在分子掩蔽效应的坚实桥接效应特点下，根据印迹分子的形状微小细小变形将有效药物固定到支撑体(亲和体)表面，用以实现目标分子的精确分离和纯化。
二、分子印迹技术在天然产物纯化中的应用
1、简化操作步骤：通过分子印迹技术可以将原来得到天然产物的复杂操作步骤简化为一步法或两步法，大大简化了操作步骤。
2、提高分离纯化效率：分子印迹技术的应用可以避免传统方法的步骤重复，减少时间耗费，从而显著提高分离和纯化的效率。
3、准确精确：分子印迹技术在天然产物分离纯化中可以实现更为准确精确，这样可以有效避免混合物污染，提高天然产物的纯度。
4、实现广泛的成分分离：分子印迹技术的分离和纯化的范围不仅限于单一的天然产物，还可以用于一级代谢物和多糖类的分离纯化。
总之，分子印迹技术在天然产物分离纯化中的应用会带来革命性的改变，它的优势显而易见，将极大地拓展分子印迹技术在天然产物分离纯化领域的应用空间，为药物研究和开发提供更好的应用价值。
印迹分子分离
印迹分子分离
印迹分子分离技术是一种基于分子互补性的生物分离技术。
它基于方法是利用特定塑
料或硅胶材料将接收到的生物样品中的目标分子吸附在芯片的表面上，并通过特定的抗体
抗原相互作用将目标分子与其他分子分离开来。
印迹分子分离技术已经被广泛应用于药物设计、生物诊断、食品检测以及环境检测等
领域。
它能够对低浓度的目标分子进行快速、高效、选择性地分离和检测，具有非常重要
的应用价值和意义。
其中最常见的应用是在药物设计领域中，通过印迹分子分离技术，可以从复杂的混合
物中精确地提取目标化合物，从而有效地提高新药的开发效率和成功率。
此外，在生物诊
断领域中，印迹分子分离技术可以用于检测疾病标志物，如ATP、蛋白质、肿瘤标志物等，可以为生物医学研究提供重要的工具和手段。
印迹分子分离技术的优点在于其无需特殊条件即可进行，使其在现场检测和快速检测
方面更具优势。
此外，当芯片或材料的抗原抗体对已知的化学物质进行优化时，可以缩短
分离时间，增强分离选择性和灵敏度。
印迹分子分离技术在实际应用中还存在一些问题，如抗原和抗体的选择、分子的稳定
性和灵敏度等。
为了解决这些问题，研究人员已经开始开发新的材料和生物分子，以提高
分离的效果和准确性。
总的来说，印迹分子分离技术是一种十分重要的分离技术，其在很多领域的应用都表
现出了非常卓越的效果，随着分子生物学和化学技术的不断发展，它的应用前景还将进一
步拓宽和深化。
分子印迹技术和免疫亲和色谱净化技术
分子印迹技术和免疫亲和色谱净化技术哎呀，说起这个分子印迹技术和免疫亲和色谱净化技术，我可真是有话要说。
这俩技术，听着挺高大上的，其实吧，它们就像是我们生活中的小帮手，帮我们把事情做得更精细。
先说说分子印迹技术，这玩意儿其实挺神奇的。
想象一下，你手里有一堆钥匙，但是只有一把能开你家的门。
分子印迹技术就像是能记住钥匙形状的锁匠，它能够“记住”特定的分子形状，然后只让那个特定的分子通过。
这技术就像是定制版的筛子，只让特定的分子通过，其他的统统挡在外面。
记得有一次，我在实验室里，看着那些小分子在溶液里游来游去。
我们用分子印迹技术，就像是在玩一个“找到你”的游戏。
我们先把一个分子的“样子”印在材料上，然后让这个材料去“认出”溶液里的分子。
这个过程，就像是在一大堆人中找到那个你熟悉的面孔，既有趣又有点挑战性。
然后是免疫亲和色谱净化技术，这个就更有意思了。
想象一下，你有一个超级粉丝，不管你走到哪里，他都能一眼认出你。
免疫亲和色谱净化技术就是利用这种“超级粉丝”效应，用特定的抗体去“认出”并抓住特定的分子。
这个过程就像是在一场大型演唱会上，你的超级粉丝总能在人群中找到你，把你从人海中拉出来。
有一次，我在实验室里做实验，我们用免疫亲和色谱技术来分离一种蛋白质。
那个过程，就像是在一大堆音符中找到那个特定的音调。
我们把抗体固定在色谱柱上，然后让蛋白质溶液流过。
那些被抗体“认出”的蛋白质就会被抓住，其他的就流走了。
这个过程需要非常细致的操作，但是当看到那些被纯化的蛋白质时，那种成就感，真的是无法言喻。
总的来说，分子印迹技术和免疫亲和色谱净化技术，虽然听起来很复杂，但其实它们就像是我们生活中的小工具，帮助我们更精确地完成工作。
它们就像是那些能够记住你面孔的老朋友，总是在你需要的时候出现，帮你一把。
这些技术，虽然在实验室里看起来冷冰冰的，但其实它们背后的故事和细节，还是挺有人情味的。
就像我们的生活，看似平凡，但细细品味，总有那么些温暖和趣味在其中。
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亲和膜的制备过程
活化方法
1. 2. 3. 4. 5. • 环氧氯丙烷活化法 1,1’-羰基双咪唑（CDI ）法 三氯三嗪法 过碘酸钠法 戊二醛法 双环氧试剂活化法
环氧氯丙烷活化法
Cl OH OH
-
O OH O OH HN OH S OH R R RCl源自OH-O O
ROH RNH2 RSH
O O O
HO－C (532.9) (532.51) 49.74 (532.38) 70.47 (533.21) 56.82 (532.12) 100 (532.17) 79.61
C－O－C (534.3) － (533.84) 29.53 － － －
Alkali modificated HEC modificated HDA grafted Affinity membrane
间隔臂
• 当配基为小分子而纯化对象为大分子时， 需用间隔臂； • 可减小空间位阻，增大亲和容量； • 间隔臂一般为基质与配基间的长链分子； • 间隔臂长度要适当，过短起不到减小空间 位阻的作用，过长会弯曲封闭膜上的相邻 的活性位； • 一般取含六个碳原子的化合物：己二胺、 6-氨基己酸等。
间隔臂种类
—CF2 ， C ＝ O， O－C－O
(290.92) 32.51 (290.65) 31.4 (290.43) 24.91
55. 9 61. 4
HDA grafted Affinity membrane
56. 3 57. 5
21.8 23.0
18. 7 16. 5
3.2 3.0
(284.61) 31.71 (285.09) 55.98
介质 板式、卷式、中空纤维式超滤或微孔滤膜
规模 处理量大，可达克、甚至公斤级 处理量小，大多为mg级，制备级可达克级 成本 设备 速度 产物 相对较低 较简单 快 纯度相对较低 很高 较复杂 较慢 纯度很高
亲和膜分离过程
缓 冲 液 再 生 解 吸 缓 冲 液 亲 和 携 带 剂 循 环
吸 附
产 品
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 孔隙率高 内外表面积大和开放疏松的孔结构 机械性能稳定 一定的亲水性 非特异性吸附低 可反应性基团存在 结合容量高 耐溶剂冲洗 成本低
合成亲和膜的特性
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 高选择性和特异性 高蛋白质回收率 保证蛋白质与酶的活性 稳定性好 表面不带电荷 非特异性吸附低 高吸附容量
原 料 杂 质
亲和膜的构成
• L: Ligand; M: Matrix; S: Space arm
亲和膜材料
• 纤维素膜、聚酰胺膜、聚砜膜，聚烯烃膜； • 甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、全氟聚合物等； • 聚醚脲烷类膜（poly(ether-urethane-urea) 和凝胶-纤维玻璃膜。
亲和膜基质的特征
戊二醛法
O
O
NH2
N
O
H2N R
N
N
R NaBH4
NH
NH
R
双环氧试剂活化法
O O
NH2 + H2C CH CH2 O (CH2)4 O CH2 CH CH2 OH O OH NH CH 2 CH CH2 O (CH2)4 O CH2 CH CH2 OH
-
OH NH O CH CH2 O R
ROH
亲和配基与配体的相互作用
配 体 静 电 作 用 H H 配 基 氢 键 疏 水 作 用
changes of the chemical structure of the membranes surface
W(%)
Unmodifica ted
Alkali modificated HEC modificated
C
55. 4
F
38.3 31.1 26.9
O
5.6 13. 0 11. 7
N
0.6 － －
benzene
－CH3,
(285.00) 26.79 (285.04) 40.41 (284.82) 45.58
－ CH2 ， C －OH
(286.48) 40.70 (286.56) 28.19 (286.49) 29.51
主要内容
• 1. 2. • 1. 2. • 亲和膜 亲和膜分离过程与构成 亲和膜制备 分子印迹 分子印迹原理 分子印迹膜的制备 敏感膜
膜分离和亲和色谱的比较
膜分离
原理 过程 利用膜孔径大小 为低压、可连续操作
亲和色谱
利用化学和生物特异性相互作用 低、中、高压都有，为断续式操作 担体、填料，在柱中进行
疏水性间隔臂 己二胺 亲水性间隔臂 1，3-二氨基-2-丙醇、 小肽、 低聚甘氨酸 聚（L-赖氨酸）等。 间隔臂的亲、疏水性对配基的亲和力大小 及特异性吸附能力影响。
配基的种类
• 生物特异性配基
生物特异性配基是指利用自然界中特异性相互作 用生物物质对之一做配基，如酶 - 底物、酶 - 抑制 剂、激素-互补接受体、抗体-抗原等。
(285.95) 53.91 (286.38) 20.90
(289.73) 14.38 (289.77) 23.12
changes of the oxygen group of the membrane surface
W(%)
Unmodificated
O＝C (531.6) (531.38) 50.26 (532.38) 70.47 (531.58) 43.18 (532.12) 100 (530.73) 20.39
• 基团特异性配基
基团特异性配基是指对具有某一类基团或结构 的生物大分子均有特异性作用的配基，如氨基酸 、蛋白质A、活性染料、金属螯合离子等。
配基的特色
• 生物特异性配基 选择性很高，纯化倍数高，但缺点是来源缺乏， 费用高，生物、化学稳定性差，在固载化中难 于保持活性，多需预纯化，工业化难度大。 • 基团特异性配基 纯化倍数不如生物特异性配基，而有些则有毒 性如人工合成的活性染料类配基。在基团特异 性配基中氨基酸配基引人注目，因其价廉无毒 性，使用起来安全可靠。
1,1’-羰基双咪唑（CDI ）法
O N N N N O O N
OH +
H2N R
O O
NH R
N
三氯三嗪法
Cl Cl OH + Cl N N N Cl N O N Cl N HN R 2 Cl O N O N N HN R HN R N N N HN R
过碘酸钠法
N R OH NaIO4 OH O H2N R O NaBH4 NH R NH R