土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)

土壤微生物生物量的测定方法
1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）
1.1 基本原理
新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器
自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂
1）无乙醇氯仿（CHCL3）；
2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中
3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、
70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，
仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）
1.4 操作步骤
1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）
1.4.2 熏蒸
称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理
熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※
1.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

同时作3个无土壤基质空白。

土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。

1.4.5 TOC仪器测定
吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。

）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。

由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。

1.5 计算
SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.45
2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法）
土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下
2.1 基本原理（茚三酮比色法）
Amato和Ladd（1988）研究表明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为α-氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反应定量测定，并发现熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反应态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之间存在显著的相关性。

因此，人们采用熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生
物生物量氮（FE-Nnin）。

2.2 实验仪器
分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等
2.3 实验试剂
1）无乙醇氯仿（CH3Cl）；
2）0.5mol/L (K2SO4)溶液：称取硫酸钾（K2SO4）87g，溶于去离子水中，稀释至1000ml；
3）pH5.2的乙酸锂（LiOH•H2O）溶液：称取氢氧化锂（LiOH•H2O）168g，加
入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%氢氧化钠溶
液调节pH至5.2。

4）茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液50ml加入4g 水
合茚三酮（C9H4O3•H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6•2H2O）搅拌至完全
溶解；
5）50%乙醇水溶液：吸取50ml 99%乙醇于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容；6）1mol/L的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵（称前105℃烘2h）溶于0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，
摇匀，于4℃冰箱中保存。

7）0.1mol/L 的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10ml 1mol/L的硫酸铵标准
储存液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100ml，摇匀。

此
溶液最好现配现用。

8）工作曲线的制备：分别吸取0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、
4.00ml、
5.00ml 0.1mol/L的硫酸铵标准液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液
定容至100ml，摇匀，其浓度分别为0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、
1.5mol/L、
2.0mol/L、2.5mol/L硫酸铵标准氮的系列溶液。

2.4 操作步骤
2.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样）
2.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）
2.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）
2.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为2g，即，2g土：8ml的硫酸钾溶液）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

同时作3个无土壤基质空白。

土壤提取液最好
立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃※，否则将影响浸提液的效果，，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。

2.4.5 分光光度计比色测定（此处沸水浴不好控制※）
吸取0.5ml样品提取液和标准工作液，分别置于10ml的塑料离心管中，加入2ml茚三酮显色剂，涡旋搅拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴15min，迅速冷却（冰浴约2min），加入5ml稀释液（50%乙醇水溶液），摇匀于570nm下比色。

2.5 结果计算
SMBN=(E C CHCL3—E C CK)*稀释倍数*原来的水土比*5
❖土壤微生物生物量氮的测定（全氮测定法,建议使用此法）
注意：所配的试剂和全自动凯氏定氮仪的试剂一样，具体见农化分析课本
2.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样）
2.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）
2.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）
2.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管
中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，2g土：16ml的硫酸钾溶液）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

同时作3个无土壤基质空白。

土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃※，否则将影响浸提液的效果，，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。

2.4.5 全自动凯氏定氮仪的测定
吸取10ml滤液与消煮管中，加入K2SO4—CuSO4—Se混合催化剂1.08g，加入4ml浓硫酸；同时设置2—3空白（10ml的0.5mol/l的K2SO4，加入K2SO4—CuSO4—Se混合催化剂1.08g，加入4ml浓硫酸）；在高温消化（340℃消煮3个小时）至澄清后放置2-3h。

然后用全自动凯氏定氮仪测定浸提液中的全氮含量。

2.5 结果计算
E N=(V S-V O)*C H2SO4*14*1000*(16/10)÷W S
式中：E N为全氮，V O为滴定空白对照所消耗的标准硫酸体积（注意：消煮一批土样至少需要3个对照※），V S为滴定土样所消耗的标准硫酸体积，C H2SO4为硫酸浓度（这个浓度要进行标定的，具体见农化分析课本），14为氮的摩尔质量，1000为千克转化成克，16/10为从16ml的提取液中吸取10ml，W S为干土重
所以：土壤微生物生物量氮B n=(E N CHCL3—E N CK)/0,54
见《土壤微生物研究原理与方法》，主编：林先贵中科院南京土壤研究所
3 土壤微生物生物量磷（无机磷测定法）
Brookes等（1982）报道土壤熏蒸处理所释放出来的磷大部分为无机磷酸盐，可被0.5mol/LNaHCO3等提取剂提取，而且熏蒸和未熏蒸土壤之间无机磷的差异，能够反映土壤微生物生物量磷的高低。

于是，Brookes等建立了土壤微生物生物量磷的熏蒸提取---无机磷测定法。

3.1 基本原理
新鲜土壤经氯仿熏蒸后（24h），采用0.5mol/LNaHCO3溶液提取被杀死的土壤微生物生物量磷，在锑钼抗混合试剂作用下提取液中正磷酸与钼酸络合形成磷钼杂多酸（在一定酸度条件下），可用磷钼比色法测定提取液最好全磷含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机磷量的差值和转换系数（k p，这个系数很重要，因为如果没有这个系数，所测定的结果就是土壤的速效磷，但是土壤微生物熏蒸后释放的磷大多数是无机磷，而速效磷包括全部水溶性磷、部分吸附态磷及有机态磷，有的土壤中还包括某些沉淀态磷，因此速效磷和无机磷的范畴不一样，不要搞混※）以及外加无机磷的回收率（Rpi）作为校正系数，从而估算土壤微生物生物量磷。

3.2 实验设备
分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空干燥器、离心机、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等
3.3 实验试剂
1）无乙醇氯仿（CH3Cl）；
2）0.5mol/L碳酸氢钠（NaHCO3）浸提液：溶解NaHCO342.0g于800ml 水中，
以0.5mol/LNaOH溶液调节浸提液的pH至8.5，再用蒸馏水稀释至1000ml。

此溶液曝于空气中可因失去CO2而使pH增高，可于液面加一层矿物油保存。

此溶液储存于塑料瓶中比在玻璃瓶中容易保存，若储存超过一个月，应检查pH是否改变；
3）磷酸二氢钾溶液【p（KH2PO4）=250 ug p /ml】：称取1.0984g分析纯磷酸二
氢钾（称量前105℃烘2~3h※），溶于去离子水并定容至1000ml；
4）钼锑抗试剂：（间鲍士旦的土壤农化分析课本）
5）磷标准液：准确称取在105℃烘箱中烘干的KH2PO4（分析纯）0.2195g，溶
解在400ml水中，加浓硫酸5ml（加硫酸放置霉菌，可是溶液长期保存），转
入1000ml容量瓶中，加水定容至刻度。

此溶液为50ug/ml磷标准液。

吸取上
述磷标准液25ml，定容至250ml，即得5ug/mL磷标准液（此溶液不可久存
※）
6）工作曲线：准确吸取5ug/ml磷标准液0、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml分别放入25ml容量瓶中，加水至约20ml，然后加钼锑抗试剂4ml，最后用水定容至25ml。

30min后开始进行比色。

各瓶比色液磷的浓度分别为0ug/ml、0.1 ug/ml、0.2 ug/ml、0.4 ug/ml、0.6 ug/ml、0.8 ug/ml、1.0 ug/ml磷。

3.4 操作步骤
3.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样）
3.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）
3.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）
3.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到250ml聚乙烯提取瓶中，加入200ml 0.5mol/L NaHCO3浸提液（土水比为1:20，考虑到土样的不足，这个部分称取2g土，比值为2g土：40ml NaHCO3），300r/min振荡30min，用慢速定量滤纸过滤。

同时作3个无土壤基质空白。

土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）。

3.4.5无机磷的回收率（很重要※）
另称取经前处理相当于干土2.0g土样2份，分别放入三个50ml聚乙烯提取瓶，加入0.2ml 250 ug p /ml磷酸二氢钾溶液，再加入40ml 0.5mol/L 碳酸氢钠（NaHCO3）浸提液，同上进行提取。

用于测定外加正磷酸盐态无机磷
可编辑
的回收率（Rpi），以校正土壤对熏蒸处理所释放出来的微生物生物量磷的吸附和固定。

土壤提取液也立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）。

3.4.6 分光光度计比色测定
吸取10ml提取液（依样品的含磷而定）于25ml容量瓶中，加入适量的1.0mol/LHCl溶液进行中和，HCl溶液的加入量通常为提取液体积的1/2，放置4h并间隙振荡，以排除溶液中的CO2。

补充去离子水至20ml，加入4ml 混合显色剂，再加水定容，摇匀。

显色完全（约30min）后，在882nm波长处进行比色。

3.5 结果计算
土壤微生物生物量磷B P= Ept/（Kp*Rpi）单位为mg/kg
式中Ept为熏蒸和未熏蒸的土壤差值，即：(E P CHCL3—E P CK),E P CHCL3（E P CK）=W1(分光光度计的值)*2.5(容量瓶的稀释倍数)*4（40nl浸提液中取10ml）*20（水土比），Rpi=[(外加KH2PO4溶液土壤的测定值—未熏蒸土壤的差值)/25]*100%,其测定和算法也是和E P CHCL3（E P CK）一样；Kp为转化系数，取值为0.4
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