动物繁殖学课件4转基因与克隆2

生 物 反
通过生物个体代替部份 物理装置，以生物反应代 替部份化学反应，来生产 价值极高的蛋白质和多肽 物质己为可能。人们将外
前期转基因动物的研究，己证 实了人类基因不仅能在动物体内获 得表达和遗传、并能获得组织特异 性（如乳腺、血液、膀胱）和发育
应 源基因的信息转变成蛋白 特异性（如泌乳期）的表达。
应用胚胎干细胞进行基因转导，不仅整合率较高，并能在细胞水平 对外源基因的表达载体进研究筛选，结合相关技术手段，能实现定 点操作，比如基因剔除(gene knockout)、基因置换(gene knockin)。
但获得哺乳动物胚胎干细胞的克隆株系具有相当的难度。目前，该 方法仅在转基因小鼠的研究中应用较为成熟。
外源基因显微注射法具有外源基因的长度 不受限制，可直接转导不含载体的DNA片段， 实验周期短，且较安全，是目前培育转基因动 物最有效、成功率较高的技术途径；
影响因素：DNA浓度、缓冲液成份、基因 构型、注射部位等
阳性率(以移植产下的原代活仔畜计)： 小鼠(17.3%)、家兔(12.8%)、大鼠 (17.6%)、 牛(3.6%)、猪(9.2%)、绵羊 (8.3%)。
标志了人为地改变动物经济和遗传性状成为可能，开创了生命科学中新 的研究领域。
转基因动物 Transgenic animal
转基因动物是指应用生物工程技术培育的、 含在基因组内稳定地整合、并能遗传的外源基因 或特定DNA片段的动物 。
生命科学中一个多 层次、多侧面、四 维的研究体系。
继连锁分析、体细胞遗 传、DNA重组之后，遗 传学中的第四代技术。
全球排名前50位的医药企业，有75%投入转基因动物的研发。
据美国红十字会和遗传学会预测，到2010_2015年，所有 基因工程药物中，利用乳腺生物反应器生产的份额将占95%， 约300亿美元。
异 种 器 官
器官移植已成为治疗多种器官衰竭的有效手段， 因人类同种移植器官的日益缺乏，人们希望能实现异 种器官的移植。猪在解剖、生理等方面与人具有较大
●启动子(Promotor) 启动子是一DNA段，其典型结构应包括mRNA帽子位点，该位点是
mRNA转录体实际开始的地方。指导目的基因进行转录的启动子类型是决定 外源基因在体内能否稳定表达及表达率高低的关键因素。 在转基因动物研究中一般采用二类启动子。
多种组织细胞中表达：如MT(金属硫蛋白) 启动子 专一组织细胞中表达：如BLG(羊-β乳球蛋白)启动子
人类疾病 动物模型
特有性状的 经济动物
转基因动物 Transgenic animal
动物生 物反应器
异种器 官移植
动物模型(转基因鼠)
由于小鼠与人类基因具有很高的同源性，且遗传背景清 晰，因此含有人类致病基因的转基因小鼠所表现的症状，与 人类相应疾病具有很高程度的可比性和真实性。
同时，转基因小鼠通过对外源基因的操作，能从分子、 蛋白、细胞、生理、遗传等不同水平，直接研究外源基因在 个体内的动态表现，能精确地检测到一个遗传改变所发生的 效应,四维的研究体系。
Transgenic milk production herd
Induce lactation
Microinject target protein
vector
into embryo
乳腺生物
Target protein DNA Target
prot反ein应器成功的Test
offspring
expression vec基tor础和关键 for transgene
Measure Transgenic milk target protein
expression
目前，国际上己有多种转基因动物（绵羊、山羊、猪和牛） 能生产上百种医用蛋白，其中有30余种进入Ⅱ、Ⅲ期临床，有 的也己进行商业开发，产生了良好的经济效益，正逐步发展成 一新兴产业。
如荷兰金发马公司培育的转基因牛，生产人乳铁蛋白，提炼 的营养奶粉销售额为50亿美元；英国罗斯林研究所培育的抗胰 蛋白酶转基因羊，每升羊奶价值6000美元；芬兰得到红细胞生 成素的转基因牛，年产奶价值为40多亿美元。
● 染色体断裂的 概率决定了外源 基因的整合率。
● 染色体的断裂 处就是外源的整 合位点。
整合特征：非定点的随机整合 (DNA浓度、基因构型)
特点：首尾串联、单一位点的多拷贝整合。 引起插入、缺失、重复、易位等 突变
插入突变: a.致死 显性.隐性; b.非致死 表型畸变或不育
表达混乱：1.不在预期的组织内表达； 2.子代表 达情况不同；3.同一启动子在不同个体或不同动 物中表达行为不同；4.整合不表达。
转基因动物的研究
转基因动物 Transgenic animal
1980年Gordon首次获得了转基因小鼠；1982年Palmiter将大鼠生长 激素基因导入小鼠胚胎，得到生长速度快2至4倍，个体比同类大一倍的 “超级小鼠”。这一研究结果，说明通过对性细胞的操作，可以有效地将 外源基因导入动物的基因组内，并能使之表达，产生相应的生理效应。
己培育了许多种(如白血病、高血压、肿瘤、老年病等) 转基因小鼠，使人类对致病基因的发病机理、遗传规律及 基因表达与结构、环境因素的关系有了一个深入的了解， 从而能进行科学的诊治。
转基因经济动物
受“超级小鼠”的启发，人们希望通过转移和表达适当的基因， 进行转基因育种，就可以培育出生长快、节省饲料和抗病的经济动 物，使畜牧业和水产养殖业的效益成倍提高。
提高整合率、实现定点整合就成为转基因动物研 究的关键环节。
外源基因构建及转导的研究动向
1.导入较完整的基因而不是cDNA，是获得高效表达的有效途径 2.考虑与表达相关的调控元件
因外源基因的表达，受多种因素调节，如基因结构与整合位 点，与转录有关的顺式结构和反式调节因子，外源基因在宿主体 内的甲基化程度及环境因素等，这些众多的因素虽难以完全控制， 但在外源基因构建时，应考虑与表达相关的调控元件。
具有形成新兴产业 的开发前景和潜能。
反转录病毒基因转染 法
反转录病毒(retrovirus,RV)是RNA病毒，含两条RNA，进入细胞后，反转录 成双链DNA，通过DNA进行复制。己有几种哺乳类和禽类的反转录病毒，作为 转基因载体 (复制缺陷型和复制互补型)。
将外源基因与反转录病毒的原病毒重组，与细胞或胚胎共培养，通过感染将外 源基因转导到载体细胞的常染色体或性染色体上。这一过程都是由病毒编码的酶 所介导的 。
但由于动物的经济性状(如生长速度、瘦肉率、产蛋量等)一般是由 多个基因协调控制的，仅转移单个基因较难达到理想的效果。如整 合有生长激素基因的猪和羊，其血液中的生长激素水平显著提高， 在表现出生长快、饲料省、瘦肉率高的同时，也存在体质普遍下降 及有繁殖障碍等不良性状，难以推广应用。转基因鱼是个例外。
因此，在转基因育种方面尚有待新技术、新理论的突破。
●可遗传，一旦获得一个生产某种有价值蛋白 质的动物个体，通过常规繁育可扩大群体。
●成本低，虽前期投资大，但生产群体维持生 产费用却很少。
产出含医用蛋白的牛奶
Isolate fertilized embryos
Goat beta casein DNA
Transfer into recipient female
图为2001年12月 底出生的5只可爱的 转基因克隆小猪。据 培育者英国PPL医疗 公司称，这些转基因 小猪将为研究和“生 产”适用于人体移植 手术使用的动物器官 提供巨大的帮助。
外源基因整合的假说：
注入的线性DNA分子游离未端所诱导的修复酶 可能引起染色体的随机断 裂，DNA未端与染色体断裂处之间相互作用使外源基因整合进基因组。
器 质的生物体(通常分为植物、 动物两大类)称为生物反应
其中以乳腺生物反应器的进展
器。
最引人注目。
转入人医用蛋白基因
●动物乳腺是一个封闭系统，外源基因局限 在乳腺表达，可避免外源蛋白对动物健康的危害。
●产量高，一头牛可年产乳蛋白250-300千克， 绵羊和山羊也可产25-30千克。
●活性好，乳腺组织可以对人体蛋白质进行正 确修饰和后加工，产品的生物活性接近天然产品。
已获得整合有生长激素（GH）、生长激素释放因子（GRF）、 肌肉生长刺激因子（cSK1）及能提高羊毛质量、牛奶产量等外源 基因的转基因家畜。其中含有GH的转基因猪己稳定地的遗传了五 个世代，其血液中GH均保持较高浓度，虽个体不比同胞更大，但 体重增长较快，料肉转化率提高17%，背膘厚度从18.5±1.8毫米 下降到7.0±1.8毫米；
优点:单拷贝基因导入且转导效率高，可达100%；整合常发生在病毒基因片段 上，宿主基因不会被破坏；整合受病毒基因插入机制控制，不易发生大的突变； 单一位点整合，易分析插入位点；
缺点:经嵌合体途径，实验周期长；转导基因不能超过10kb；不安全。在外源 基因整合的同时，病毒基因也被整合到宿主染色体上，造成野生型病毒污染，有 突变成新病毒及激活致癌原基因的可能。
精子载体法转基因
子 以精子作为基因的裁体制作转基因动物以其简单、高效、 广泛适用的特点引起众多的科学家的广泛兴趣，大量实验证实， 精子能够吸附外源DNA，而且大多数被吸附的外源DNA位于 精子头部的赤道段和顶体后区，精子这种吸附DNA的能力不 是简单的物理过程而是由精子头部蛋白所介导的。
子 极少数DNA能够穿入精子核区，这部分DNA在核区内有的 被降解；有的以附加体形式存在于基因组之外，只有极少数能 够整合到基因组上，而且这种整合不是随机发生的。 子 虽然精子吸附外源基因，通过体外受精或人工授精的途径 制作转基因动物的阳性结果和阴性结果的报道时有发表，但是 这些实验之间转基因效率差异极大，而且未能获得足够的数据 对这一差异提供解释， 子 没有从理论上阐明精子携带外源基因入卵的机制，也没有建 立一套可重复性的稳定的制作转基因动物技术路线。