分枝杆菌菌种鉴定1

分枝杆菌菌种鉴定

1 检测范围

用于定性检测来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株样本中的核酸,检测指标包括临床常见分枝杆菌的17个种或群,包括:结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。可用于结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病的辅助诊断,也可用于流行病学调查等领域。

2 方法原理

基因芯片( genechip)也称为DNA芯片、DNA微陈列、寡核苷酸陈列,是指采用原位合成(或显微打印手段),将DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针陈列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。基因芯片对分枝杆菌的菌种鉴定通过在芯片上设计种属特异性寡核苷酸探针,将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交反应,根据碱基互补配对原则,序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。根据探针在芯片上的特定位置排布,就可以推断出相应

被测细菌的相关信息,鉴定出被测细菌的种类

采用基因芯片微量点样技术,将检测上述基因的特异探针与各种对照探针固定在基片上,检测探针和对照探针各重复5个点,形成12行×10列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列,每一个微阵列可以检测一份样品。

3 检测样本

检测适用的标本类型为来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non- tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株。存在于固体培养基上的待测分离株样本不可冷冻储存，因为冷冻会对后续操作造成影响；存在于液体培养基中的待测分离株样本在-70℃储存不超过5年。

用于培养的样本为取自患者的痰、脓液或分泌物、肺泡灌洗液、穿刺液（包括脑脊液、胸腹水、心包液、关节液、胆汁等）、尿液。

储存：待测分离株样本在2-8℃储存不超过2个月。

4 仪器设备

PCR扩增仪、普通台式离心机、LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪、微阵列芯片杂交仪、芯片洗干仪、微型高速离心机、涡旋振荡器、水浴锅。

5试剂耗材

5.1 试剂

5.1.1芯片洗涤液：

芯片洗涤液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2%。依次将20×SSC、蒸馏水（或纯化水）、10% SDS按照10 : 88 : 2的比例混合，即为芯片洗涤液Ⅰ。以配制总量600 ml为例：量取60 ml 的20×SSC及528 ml的蒸馏水（或纯化水）置于1 L的烧杯中，混匀。再加入12 ml的10% SDS，混匀。

芯片洗涤液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。将20×SSC、蒸馏水（或纯化水）按照1: 99的比例混合，即为芯片洗涤液Ⅱ。以配制总量600 ml为例：量取6 ml 的20×SSC及594 ml的蒸馏水（或纯化水）置于1 L的烧杯中，混匀。

提示：若10% SDS产生白色絮状沉淀，请于50℃融化混匀后配制芯片洗涤液。若芯片洗涤液Ⅰ产生白色絮状沉淀，请于50℃融化混匀，然后平衡至室温再使用。

5.1.2纯化水或者蒸馏水

5.1.3 冰水混合物（取冰盒加水，冰冻2.5小时，因为扩增需要2.5个小时，所以在扩增开始时准备冰盒）

5.1.4核酸提取液

5.1.5P CR扩增试剂

5.1.6杂交缓冲液

5.2耗材

5.2.1 HybSet基因微阵列芯片杂交盒

5.2.2 微量移液器（规格：0.1-10 μl，2-20 μl，20-200 μl）5.2.3 移液器吸头（要求洁净无菌，规格：0.1-10 μl，2-20 μl，

20-200 μl）

5.2.4 离心管（要求洁净无菌，规格：200 μl，1.5 ml）

5.2.5 八连排管（可选，要求洁净无菌，规格：200 μl）

5.2.6 各种规格的离心管架

6操作步骤

6.1核酸提取

6.1.1 准备工作

取与标本数相同的1.5ml离心管，编号，取80µL核酸提取液于1.5ml离心管

6.1.2分离菌株样本的采集

从合适的固体培养基上用无菌的接种环挑取一个肉眼可见的菌落（若菌生长布满整个培养基，则挑取相应大小的菌苔）于含核酸提取液的核酸提取管中，即可进行后续的核酸提取。尽量避免挑取固体培养基。液体培养基（先混匀）内样本直接吸取等于或大于1个麦氏浊度的菌悬液10-20µL。

6.1.3核酸提取

加入上述采集的分离株样本后，使用Extractor 36核酸快速提取仪振荡5分钟，95℃水浴30分钟，12000 rpm离心5分钟，此时得到的上清液就是核酸提取液，

6.1.4取30µL于0.5ml离心管，瞬间离心10秒，此步骤使核酸提取

液离到离心管底部，得到的核酸放置-20℃暂存（不超过2个月）。

6.2PCR扩增

6.2.1配制PCR反应体系

在PCR配液区内，根据被测样品数目准备200 μl八连排管，并

预先标记样品编号。从试剂盒中取出PCR扩增试剂使其充分融化

（自然解冻），轻摇混匀后瞬时离心（离心机瞬离5秒）至管底。

6.2.2根据样品数目，将PCR扩增试剂按18 μl/管分装于200

μl八连排管中，盖好管盖，然后将其转移至PCR扩增区。

在PCR扩增区内加入2 μl模板DNA。模板DNA包括被测

样品DNA（核酸提取管中的上清液）、阳性对照品或者阴性

对照品。此时得到的每份PCR反应体系总体积为20 μl。建议：每次扩增时均使用阳性对照品和阴性对照品，其中阳性对照品可用于PCR扩增和杂交过程的质控。阴性对照品可用于监测环境及操作过程中的污染情况