分枝杆菌菌种鉴定1
微生物检验学之分枝杆菌属及检验
分枝杆菌属及检验分枝杆菌属是一类细长或略带弯曲、为数众多（包括54个种）呈分支状生长的需氧杆菌。
因其繁殖时呈分支状生长故称分枝杆菌。
本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂类，可占其干重的60%，这与其染色性、抵抗力、致病性等密切相关。
耐受酸和抗乙醇，一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后，能抵抗3%盐酸乙醇的脱色作用，故又称抗酸杆菌。
需氧生长，无鞭毛，无芽胞和荚膜。
引起的疾病均为慢性，有肉芽肿病变的炎症特点。
分枝杆菌的种类较多，包括结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌和麻风分枝杆菌。
非典型分枝杆菌是一大群分枝杆菌的总称，与人类有关的非典型分枝杆菌主要有堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈分枝杆菌、鸟分枝杆菌、蟾分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌和耻垢分枝杆菌等。
本属细菌无内外毒素，其致病性与菌体某些成分如索状因子、蜡质D及分枝菌酸有关。
根据国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）的方案将本属细菌分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌。
一、结核分枝杆菌在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。
（一）生物学特性1.形态与染色结核分枝杆菌为细长或略带弯曲的杆菌。
在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。
抗酸染色时因菌体含有大量脂类而不易着色，无论是否经碘液处理，着色后均不易被盐酸乙醇脱色，所以使菌体呈红色。
本菌无芽胞、无鞭毛，近年发现有荚膜。
2.培养特性本菌专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%CO2环境中可刺激其生长。
烛缸不适合本菌培养，需用二氧化碳培养箱。
培养温度适应范围较大，35～40℃均可生长，最适温度为35～37℃。
最适pH为6.5～6.8。
兼性胞内寄生菌，在细胞内外均可发育繁殖，强毒株可长期生存于巨噬细胞内。
生长时还需适当的湿度。
本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18小时一代。
在固体培养基上，一般需2～6周才能长出菌落。
菌落呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。
分枝杆菌菌种鉴定1
分枝杆菌菌种鉴定1 检测范围用于定性检测来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株样本中的核酸,检测指标包括临床常见分枝杆菌的17个种或群,包括:结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。
可用于结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病的辅助诊断,也可用于流行病学调查等领域。
2 方法原理基因芯片( genechip)也称为DNA芯片、DNA微陈列、寡核苷酸陈列,是指采用原位合成(或显微打印手段),将DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针陈列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。
基因芯片对分枝杆菌的菌种鉴定通过在芯片上设计种属特异性寡核苷酸探针,将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交反应,根据碱基互补配对原则,序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。
根据探针在芯片上的特定位置排布,就可以推断出相应被测细菌的相关信息,鉴定出被测细菌的种类采用基因芯片微量点样技术,将检测上述基因的特异探针与各种对照探针固定在基片上,检测探针和对照探针各重复5个点,形成12行×10列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列,每一个微阵列可以检测一份样品。
3 检测样本检测适用的标本类型为来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non- tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株。
存在于固体培养基上的待测分离株样本不可冷冻储存，因为冷冻会对后续操作造成影响；存在于液体培养基中的待测分离株样本在-70℃储存不超过5年。
040分枝杆菌菌种鉴定标准规程
1.分枝杆菌菌种初步鉴定：1.1试剂：见培养基配制标准程序1.2 接种方法:与药物敏感试验相同，10-2mg／ml菌液，接种0.1ml。
37℃孵育，每周观一次，快速生长非结核分枝杆菌一周内可生长菌落，缓慢生长分枝杆菌，四周报告结果。
与药物敏感性试验同步进行。
1.3 结果与报告分枝杆菌菌种初步鉴定结果见表PNB TCH牛分枝杆菌 - -结核分枝杆菌 - +非结核分枝杆菌 + +参考文献:结核病诊断细菌学检验规程2.分枝杆菌菌种系统鉴定：临床分离分枝杆菌菌株，经PNB、TCH等鉴别培养基初步鉴定后，确定为非结核分枝杆菌者或药物敏感试验耐PAS的分离菌株，以及临床提出需作菌种鉴定的菌株，可按下列方法进行系统鉴定。
2.1 培养特性2.1.1 生长速度接种原始分离株的次级培养物10-2mg／ml菌液0.1ml于改良罗氏培养基上，分别置于37℃;45℃和28℃孵育，一周之内生长菌落者为快速生长分枝杆菌。
一周后生长者为缓慢生长分枝杆菌。
2.1.2色素产生将分离菌株接种两支改良罗氏培养基，一支用锡纸或黑纸包缠密封，另一支不包纸，二者一起放入37℃孵育，待不包纸管长出菌落时，开启包纸管观察，有色素产生为暗产色菌。
无色素者，开启试管胶塞通气，以100瓦钨灯泡在相距450cm处照射2—3h，继续放37℃孵育3天，每天观察一次，产生色素者则为光产色菌。
不论照光与否，菌落均无色素产生者为不产色菌。
2.2 生化试验2.2.2 耐热触酶试验（1）原理：有些分枝杆菌经68℃处理后，产生的过氧化氢酶仍保持活性，可分解过氧化氢。
（2）试剂：a)pH7.0 1／15M磷酸盐缓冲液(PB)b)30％过氧化氢溶液(H202)c)10％吐温一80溶液 121℃ 10min灭菌，4℃保存。
(3) 方法：取生长在改良罗氏培养基3—4周的菌落磨菌比浊制备10mg／ml 菌悬液，取0.5ml混悬于含试剂(1)1.0ml试管内，放入68℃水浴20min，待冷却后，缓缓滴加37％H202与10％吐温-80等量混合液0.5ml(此液临用前配制)。
博奥生物 分枝杆菌菌种鉴定 注册证书
博奥生物分枝杆菌菌种鉴定注册证书
摘要：
一、博奥生物简介
1.博奥生物的发展历程
2.博奥生物的业务领域
二、分枝杆菌菌种鉴定
1.分枝杆菌的概念和特点
2.分枝杆菌菌种鉴定的重要性
3.博奥生物在分枝杆菌菌种鉴定方面的技术优势
三、注册证书的意义
1.注册证书的作用和价值
2.博奥生物分枝杆菌菌种鉴定注册证书的获得
四、未来发展展望
1.博奥生物在生物领域的持续发展
2.分枝杆菌菌种鉴定在行业中的广泛应用
正文：
博奥生物作为一家在生物领域有着丰富经验的公司，长期致力于为客户提供高质量的生物产品和服务。
非结核分枝杆菌的菌种鉴定方法课件
3
分子生物学方法
该方法准确度高、速度快，但需要昂贵的仪器 和试剂，且操作复杂。
实验数据的处理方式
数据分析
利用统计学方法和计算机技术对 实验数据进行处理和分析，以获 得更准确的鉴定结果。
数据标准化
将实验数据进行标准化处理，以 消除误差和偏差，提高数据质量 。
数据可视化
将实验数据进行可视化处理，以 直观地展示数据变化趋势和结果 ，方便实验人员分析和比较。
双向电泳鉴定
总结词
双向电泳是一种分离蛋白质混合物的方法，通过在两个方向上对蛋白质进行 电泳分离，从而获得蛋白质的详细信息。
详细描述
在双向电泳中，蛋白质首先在第一个方向上进行电泳分离，然后在第二个方 向上进行电泳分离。这样可以获得蛋白质的详细信息，如分子量、等电点、 糖基化等，从而进行蛋白质鉴定。
蛋白质芯片鉴定
THANKS
基因芯片鉴定具有高灵敏度、高特异性、可重复性好等优 点，适用于临床和环境样本中多种细菌的鉴定。
04
蛋白质分析鉴定方法
质谱鉴定
总结词
质谱鉴定是一种常用于蛋白质分析的方法，通过将蛋白质离 子化并将其引入质谱中进行测量，从而获得蛋白质的结构和 相对分子质量等信息。
详细描述
质谱鉴定的原理是将蛋白质分子电离并使其进入磁场或电场 中运动，根据其质量和电荷比值的不同，形成不同的离子峰 。通过对离子峰的分析，可以获得蛋白质的结构和相对分子 质量等信息，从而进行蛋白质鉴定。
05
比较分析鉴定方法
进化树比较鉴定
总结词
同源性分析、遗传距离分析、系统发生树构建
详细描述
通过序列比对，找出非结核分枝杆菌菌种间的遗传差异，构建进化树，根据 菌种在进化树上的亲缘关系进行鉴定
分支杆菌菌种快速鉴定
分支杆菌菌种快速鉴定目前，常规的分支杆菌菌种鉴定需采用分支杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长温度、光产色实验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原实验、烟酸试验、吐温-80水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收实验、亚硝酸盐还原试验)等10余项试验，综合分析判定结果，方法复杂、费时，慢生长分支杆菌需3~4周方可获得结果，且准确度较差，难以满足临床诊断和治疗的需要。
本实验以分支杆菌rpo β基因为靶基因序列，应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCA-RDBHA)快速鉴定分支杆菌临床分离株至种的水平，结果报道如下：1材料与方法1.1材料1.1.1分支杆菌分离株经抗酸染色涂片检测阳性的分支杆菌临床分离株126株，来自我院结核科和解放军第三〇九医院。
1.1.2引物及探针引物Ⅰ和Ⅱ型及21中分支杆菌寡核苷酸探针序列参照文献有伤害生工生物工程有限公司合成。
引物Ⅰ和Ⅱ扩增360bpNDA片段。
分支杆菌属、结核分支杆菌属复合群、鸟分枝杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分支杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分支杆菌、偶然分支杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分支杆菌、戈登分支杆菌、苏加分支杆菌、马尔摩分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、微黄分支杆菌、土地分支杆菌、耻垢分支杆菌、不产色分支杆菌和草分枝杆菌菌种对应的探针分别命名为pMyc、pTub、pAvi、pInt、pKan、pAbs、pScr、pGas、pFor、pChe、pMar、pSim、pGor、pSzu、pMal、pXen、pFla、pTer、pSme、pNon和pPhl。
1.2方法1.2.1DNA模板制备刮取改良罗氏培养基上的分支杆菌临场分离株培养物少许，混悬于1ml 无菌TE缓冲液的1.5ml离心管内，10000r/min离心10min，去上清，沉淀加入DNA提取液50µl，煮沸15min，离心取上清作为NDA模板。
结核分枝杆菌的检验及鉴别
结核分枝杆菌的检验及鉴别【摘要】分枝杆菌属是一类细长略弯曲的细菌，有分枝生长趋势，可呈丝状或菌丝样生长。
无鞭毛，无芽孢。
本属细菌的主要特点是细胞壁脂质含量高，其主要成分是分枝菌酸。
本菌需氧，营养要求特殊，大多数生长缓慢，个别菌种目前尚不能人工培养。
结核分枝杆菌复合群是人类结核病的主要病原体，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。
【关键词】分枝杆菌；检验1生物学特性1.1形态染色结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，单个、成堆或呈束状排列，大小（0．3～0．6）μm×（1～4）μm，形态如球状、串珠状或丝状，革兰染色不易着色，抗酸染色阳性，一般分枝杆莴采用齐-尼（Ziehl-Neelsen，E-N）抗酸染色后，结核分枝杆菌呈红色，非抗酸菌染色呈蓝色。
1.2培养特性本菌为专性需氧菌。
最适生长温度为37℃，低于30℃不能生长。
pH 6．5～6．8。
营养要求较高，但生长缓慢。
必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能良好生长。
本菌在培养基上缓慢生长，一般2～4周才能生长出菌落。
菌落表面干燥、粗糙、隆起、呈颗粒状、结节状或菜花状、乳A色或淡黄色，不透明。
结核分枝杆菌在5％～l0％的C02条件下对其生长有促进作用。
其对营养要求高，对一些营养成分有特殊的要求。
例如，结核分枝杆菌专嗜甘油为碳源，而牛分枝杆菌则以丙硐酸盐为碳源。
天冬酰胺是结核分枝杆菌生长最好的氮源，钾、镁、铁、磷等无机离子对其生长有促进作用。
1.3生化反应结核分枝杆菌的生化反应不活泼。
不发酵糖类。
多数菌株触酶试验阳性，但68℃加热后酶活性消失即热触酶阴性，借此可与非结核分枝杆菌区别，后者热触酶试验大多阳性。
结核分枝杆菌硝酸盐还原试验、烟酸试验和烟酰胺酶试验阳性，而牛分枝杆菌则为阴性，可有助于两菌的鉴别。
2细菌学检验结核病的症状和体征往往都不典型，虽可借助x线摄片诊断，但确诊仍依赖于细菌学检验。
非结核分枝杆菌的菌种鉴定方法课件
基于表型特征的鉴定方法传统生物学鉴定法基于菌落形态、染色特性、生化反应等表型特征进行鉴定鉴定时间长，主观误差较大自动化仪器鉴定法基于自动化仪器检测进行菌种鉴定，提高准确性和效率仪器成本高，普及程度有限基于分子生物学的鉴定方法基于基因序列的鉴定法对菌种进行基因序列分析，比对已知基因型，确定菌种分类准确度高，可检测未知菌种基于基因芯片的鉴定法利用基因芯片技术检测菌种的特异性和基因表达情况快速简便，可检测多种菌种
xx年xx月xx日
非结核分枝杆菌的菌种鉴定方法课件
CATALOGUE
目录
绪论基础知识非结核分枝杆菌的分离与培养生理生化鉴定分子生物学鉴定临床意义与防治策略复习与思考
绪论
01
1
课程背景
2
3
非结核分枝杆菌（NTM）的感染病例逐年增加
NTM对常用抗结核药物产生多重耐药性，治疗难度大
菌种鉴定对于诊断NTM感染、指导治疗和防控传播具有重要意义
诊断和治疗
02
提高诊断准确性，及时采集标本进行培养、分离、药敏试验等；根据药敏试验结果选择敏感抗生素治疗，并密切监测病情变化。
耐药性监测
03
建立耐药性监测系统，及时发现和隔离耐药菌株，控制耐药性的传播。
疫苗研究
研究新型疫苗，提高疫苗的保护效果和覆盖面。
耐药性机制
深入研究耐药性产生和传播机制，为耐药性的防控提供理论依据。
非结核分枝杆菌的分布
广泛存在于自然环境中，如土壤、水源、动物等。
非结核分枝杆菌的种类与分布
菌种鉴定基本流程
通过培养基分离纯培养物。
菌种分离
初步鉴定
生理生化鉴定
分子生物学鉴定
根据菌落特征、细胞形态等初步判断菌种类型。
进行一系列生理生化实验，如氧化酶试验、硝酸盐还原试验等，进一步确定菌种类型。
分枝杆菌菌种鉴定
实验室可鉴定菌种：结核、牛、堪萨斯、海鱼、瘰疬、鸟、胞内、偶然、龟、脓肿等分枝杆菌临床意义为致病菌；
戈登、蟾蜍、次要、耻垢、草分枝杆菌等临床意义为条件致病菌；.
分枝杆菌菌种鉴定常规实验包括：
一、对硝基苯甲酸（PNB）生长实验：鉴别结核分枝杆菌复合群或NTM菌群
二、噻吩-2-羧酸肼（TCH）生长实验：鉴别结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌
三、硝酸还原实验：鉴别结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌
四、5%NaCl培养基实验：
五、谷氨酸纳葡萄糖琼脂培养基生长实验：鉴别胞内、鸟分枝杆菌；
六、麦康凯琼脂培养基生长实验：主要用于快速生长菌的鉴别
七、吐温—80（Tween）水解实验：某些分枝杆菌具有一种酯酶，可分解Tween-80成为油酸等物质
八、尿素酶实验：某些分枝杆菌产生尿素酶，可分解尿素使菌悬液呈红色
九、芳香硫酸酯酶实验：某些分枝杆菌产生芳香硫酸酯酶
十、铁离子吸收实验：某些分枝杆菌具有还原铁盐的能力。
铁离子被吸收后；菌落呈铁锈色。
十一、亚碲酸盐还原实验：某些分枝杆菌可使碲盐还原为金属碲，使培养物呈黑色或深棕色沉降物。
人生中最幸福的就是身体健康
痰、胸腔积液、气管镜洗刷物等涂片脱落细胞检查的临床意义：是肺癌病理学诊断和临床鉴别诊断的依据。
微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程
微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程1. 概述分枝杆菌属是一类细长的、具有分枝生长趋势的需氧杆菌，因具有耐受或抵抗酸和乙醇脱色的特点，又称为耐酸或抗酸菌。
分枝杆菌属至今已发现80多个种，除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌外，其他分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等，统称为非结核分枝杆菌。
2. 标本类型痰液、体液（包括脑脊液、腹水、胸水）组织，粪便等标本。
3. 鉴定3.1 形态与染色：菌体细长，或稍弯曲，两端钝圆，大小为（0.2~0.5um）×（1~5um）。
革兰染色不易着色，抗酸染色呈红色。
以痰液直接涂片，结核分枝杆菌多为单个存在，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。
荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下观察呈金黄色荧光。
3.2 培养特性：结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代约需18h，因此在罗氏固体培养基上需要培养2~6星期方可见到菌落。
菌落多为粗糙型，不透明，乳白为米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花。
液体培养基中结核分枝杆菌生长较快，可形成表面菌膜或沉于管底。
3.3 生化反应：不发酵糖类，耐热触酶、耐热磷酸酶和吐温80水解试验均阴性，尿素酶、中性红、结核分枝杆菌烟酸、烟酰胺酶和硝酸盐还原试验均阳性。
3.4鉴别要点：3.4.1 本菌特征：菌体细长，抗酸染色呈红色；生长缓慢，菌落乳白或米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花状；不发酵糖类，尿素酶、中性红试验阳性。
3.4.2 与牛分枝杆菌的鉴别：结核分枝杆菌菌体细长，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阳性；牛分枝杆菌菌体较短、较粗，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阴性。
3.5 操作步骤3.5.1 中性培养基3.5.1.1 标本的处理痰液：挑取约5ml痰液至已标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.体液（包括脑脊液、腹水、胸水）：无菌体液直接接种；标本量>10ml,离心3000r/min，15分钟，取沉淀物接种；污染标本，须同痰液处理方法后再接种。
分枝杆菌分离培养、药敏试验及菌种鉴定方法标准化(PPT-80)
分离出具有活力的纯培养物，为进一步试验提 供基础。
分离培养的缺点
需时长，根据接种量的大小，一般2~8周 才能得到肉眼可见菌落。
结果受标本保存运送时间，培养基成分 和质量，前处理方法等影响，操作较直 接涂片法复杂，需经严格培训。
1/4．
分离培养的注意事项
选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行 培养阳性率较高。
从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟. 涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产
生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方
可报告阳性。
分离培养的优点
敏感性较直接涂片法高，理论上10~100条菌/ 毫升可检出阳性；
特点：简便、快速，可进行药敏试验及初步菌 种鉴定。连续测定荧光强度，每60分钟自动测 一次，无放射性污染。
分枝杆菌种类
分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分 枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分 枝杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结 核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM）
结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌， 此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人 类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较 弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆 菌对人类无致病性。
在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。
结核菌生长的适宜温度和人体相近为 37℃。
结核菌生长所必须的元素有氧、碳、氮、 氢、磷、钾、镁等。
结核分枝杆菌的生长特性
生长适宜温度37℃，PH6.8~7.2，对营养要求 较高专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮 源。在常用的罗氏培养基上生长的菌落粗糙、 凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜 花样，乳白色或米色，不透明。
分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂盒
Bactec TB960 系统
含硝基苯甲酸(PNB)和2-噻吩羧酸肼(TCH)培养能快 速鉴别结核和非结核分枝杆菌，但很难将非结核分枝杆 菌进一步分型。
结核（人型） 结核（牛型）
非结核Βιβλιοθήκη PNB 不长 不长 长TCH 长 不长 长
产品特点
MSM MTC MTR
MIN MAV MAU
MKA MSC MGA
主讲内容:
➢ 产品 ➢ 竞争对手
产品背景
根据国际分类法，将分枝杆菌分为三大类（Runyon分类法）： 一、缓慢生长菌群
1．结核菌群（又称结核分枝杆菌复合群）：包括人型结核杆菌，牛型结核 杆菌，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌。 2．I群光产色菌。如：堪萨斯、海分枝杆菌等。 3．Ⅱ群暗产色菌。如：瘰疠、戈氏分枝杆菌。 4．Ⅲ群不产色菌。如鸟型、胞内、溃疡分枝杆菌等。 二、 迅速生长菌 即Ⅳ群菌，包括偶发、龟、耻垢分枝杆菌等。 三、需要特殊营养菌 包括麻风分枝杆菌、鼠麻风分枝杆菌、副结核分枝杆菌。 Runyon分类法中的 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ群分枝杆菌又称为非结核分枝杆菌 (nontuberculosis mycobacteria ，NTM)
➢ 公司：生物梅里埃中国
➢ 产品名称：
➢ Geno type Mycobacterium CM(common mycobacteria)(13种 )
➢ Geno type Mycobacterium AS(additional species)(16种)
韩国REBA Myco-ID
Thank you
致病性 结核病 麻风病 结核样病变 成人类似结核病，儿童淋巴腺炎 儿童淋巴结炎 皮肤创伤后脓肿 皮肤创伤后脓肿 皮肤创伤后脓肿 水中擦伤的皮肤感染及溃疡病变 类似结核病 局部脓肿 皮肤广泛坏死和溃疡
分枝杆菌微生物学查验
分枝杆菌1. 分枝杆菌属(Mycobacterium)：（1）一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜；（2）抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌；（3）营养要求较高，常常利用罗琴培育基；（4）生长缓慢，2~8周后方可见菌落；（5）G+C mol%为62%~70%；（6）由于结核分枝杆菌的耐药和AIDS发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一个严峻的全世界性公共卫生问题。
2. 主要致病种类：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌3. 分枝杆菌属分类（1）典型结核分枝杆菌：人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌（2）非典型分枝杆菌：（3）其他：副结核分枝杆菌、麻风杆菌、鼠麻风杆菌4. 结核分枝杆菌（1）临床意义A. 本菌抵抗力强，可存活6~8月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺泡发育繁衍致使结核发生；B. 引发结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所不同，全世界约有1/3人感染，有人类死亡之首和白色瘟疫之称；C. 免疫性：有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。
D. 细菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引发相应的结核病（2）致病物质荚膜：抗吞噬；细胞壁脂质；磷脂：刺激单核细胞增生、结核结节形成、干酪样坏死；分枝菌酸：抗酸性；索状因子：破坏线粒体膜；蜡质D：诱发IV型超敏反映；硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞；蛋白质；致病机制：胞内寄生，细胞免疫为主，在巨噬细胞中存活，引发Ⅳ型超敏反映。
（3）结核结节的形成：A. 是单核细胞参与的炎性肉芽肿反映，是细胞免疫和IV型变态反映平衡的结果；B. 细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。
3~6周后，细胞变形，IV 型变态反映产生；C. 磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。
抑制蛋白酶对组织溶解，产生干酪样坏死；（4）Koch现象（郭霍现象）和IV型变态反映：有毒结核分枝杆菌被第一次接种豚鼠10－14天，局部产生末节，形成肿块→坏死溃疡侵入周围淋巴结→淋巴血流全身播散，经久不愈→动物死亡。
结核病感染早期对分枝杆菌菌种鉴定的分析
结核病感染早期对分枝杆菌菌种鉴定的分析结核病在我国有着长久的历史，是一种很早就被人类所认识的传染性疾病之一，也是一种常见病、多发病，曾一度被控制，但随着耐药菌株的出现、不合理用药等，近年来结核病的发病趋势又呈逐渐上升态势，再次对公共卫生构成严重威胁。
2009 年WHO 报告在全球22个结核及耐药结核高负担国家中我国位列第二，仅次于印度[1]。
2010年全国第五次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，西部地区患病率明显高于中部和东部地区，乡村高于城镇，调查结果提示结核病疫情虽然有所下降，但结核病特别是耐药结核负担仍然很重[2]。
非结核分枝杆菌（NTM）与结核分枝杆菌（TB）所引发的脊柱结核病例临床表现十分相似，但NTM 对结核一线药物异烟肼和利福平等的不敏感率达到83.7%，而且目前在疑似结核病的临床病例中，非结核分枝杆菌感染所占比例高达11.1%，近年来研究发现致病性的NTM 随着AIDS在全球迅速蔓延，同时陆续发现之前认为不致病的田鼠分枝杆菌可导致败血症，新金色分枝杆菌引起肺部感染，嗜血分枝杆菌引发眼内炎等，因此，在感染的早期快速准确的对分枝杆菌进行菌种鉴定对于疾病的诊断、治疗、控制具有重要意义。
目前常用的分枝杆菌菌种鉴定方法1.多重PCR（mutiplex PCR）：选用两对及以上的种、亚种或群特异性引物，扩增靶基因片段进行鉴定。
有学者以IS6110、32kDa 及mtp40 为靶基因设计引物直接检测临床标本，48h 内鉴定出MTC，同时也将MTB 区分出来。
但值得注意的是某些菌株缺乏IS6110 或是mtp40 可出现假阴性结果。
以同一个基因为靶基因设计的两对以上引物扩增出不同的DNA 片段也可以达到鉴别效果[3]。
2.PCR- 限制性内切酶分析法（ PCR-restriction endonucle-aseanalysis，PRA）：先通过PCR 扩增靶基因序列，产物经限制性内切酶消化，电泳后获得不同DNA 图谱，进而鉴定菌种。
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分枝杆菌菌种鉴定1 检测范围用于定性检测来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株样本中的核酸,检测指标包括临床常见分枝杆菌的17个种或群,包括:结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。
可用于结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病的辅助诊断,也可用于流行病学调查等领域。
2 方法原理基因芯片( genechip)也称为DNA芯片、DNA微陈列、寡核苷酸陈列,是指采用原位合成(或显微打印手段),将DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针陈列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。
基因芯片对分枝杆菌的菌种鉴定通过在芯片上设计种属特异性寡核苷酸探针,将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交反应,根据碱基互补配对原则,序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。
根据探针在芯片上的特定位置排布,就可以推断出相应被测细菌的相关信息,鉴定出被测细菌的种类采用基因芯片微量点样技术,将检测上述基因的特异探针与各种对照探针固定在基片上,检测探针和对照探针各重复5个点,形成12行×10列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列,每一个微阵列可以检测一份样品。
3 检测样本检测适用的标本类型为来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non- tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株。
存在于固体培养基上的待测分离株样本不可冷冻储存，因为冷冻会对后续操作造成影响；存在于液体培养基中的待测分离株样本在-70℃储存不超过5年。
用于培养的样本为取自患者的痰、脓液或分泌物、肺泡灌洗液、穿刺液（包括脑脊液、胸腹水、心包液、关节液、胆汁等）、尿液。
储存：待测分离株样本在2-8℃储存不超过2个月。
4 仪器设备PCR扩增仪、普通台式离心机、LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪、微阵列芯片杂交仪、芯片洗干仪、微型高速离心机、涡旋振荡器、水浴锅。
5试剂耗材5.1 试剂5.1.1芯片洗涤液：芯片洗涤液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2%。
依次将20×SSC、蒸馏水（或纯化水）、10% SDS按照10 : 88 : 2的比例混合，即为芯片洗涤液Ⅰ。
以配制总量600 ml为例：量取60 ml 的20×SSC及528 ml的蒸馏水（或纯化水）置于1 L的烧杯中，混匀。
再加入12 ml的10% SDS，混匀。
芯片洗涤液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。
将20×SSC、蒸馏水（或纯化水）按照1: 99的比例混合，即为芯片洗涤液Ⅱ。
以配制总量600 ml为例：量取6 ml 的20×SSC及594 ml的蒸馏水（或纯化水）置于1 L的烧杯中，混匀。
提示：若10% SDS产生白色絮状沉淀，请于50℃融化混匀后配制芯片洗涤液。
若芯片洗涤液Ⅰ产生白色絮状沉淀，请于50℃融化混匀，然后平衡至室温再使用。
5.1.2纯化水或者蒸馏水5.1.3 冰水混合物（取冰盒加水，冰冻2.5小时，因为扩增需要2.5个小时，所以在扩增开始时准备冰盒）5.1.4核酸提取液5.1.5P CR扩增试剂5.1.6杂交缓冲液5.2耗材5.2.1 HybSet基因微阵列芯片杂交盒5.2.2 微量移液器（规格：0.1-10 μl，2-20 μl，20-200 μl）5.2.3 移液器吸头（要求洁净无菌，规格：0.1-10 μl，2-20 μl，20-200 μl）5.2.4 离心管（要求洁净无菌，规格：200 μl，1.5 ml）5.2.5 八连排管（可选，要求洁净无菌，规格：200 μl）5.2.6 各种规格的离心管架6操作步骤6.1核酸提取6.1.1 准备工作取与标本数相同的1.5ml离心管，编号，取80µL核酸提取液于1.5ml离心管6.1.2分离菌株样本的采集从合适的固体培养基上用无菌的接种环挑取一个肉眼可见的菌落（若菌生长布满整个培养基，则挑取相应大小的菌苔）于含核酸提取液的核酸提取管中，即可进行后续的核酸提取。
尽量避免挑取固体培养基。
液体培养基（先混匀）内样本直接吸取等于或大于1个麦氏浊度的菌悬液10-20µL。
6.1.3核酸提取加入上述采集的分离株样本后，使用Extractor 36核酸快速提取仪振荡5分钟，95℃水浴30分钟，12000 rpm离心5分钟，此时得到的上清液就是核酸提取液，6.1.4取30µL于0.5ml离心管，瞬间离心10秒，此步骤使核酸提取液离到离心管底部，得到的核酸放置-20℃暂存（不超过2个月）。
6.2PCR扩增6.2.1配制PCR反应体系在PCR配液区内，根据被测样品数目准备200 μl八连排管，并预先标记样品编号。
从试剂盒中取出PCR扩增试剂使其充分融化（自然解冻），轻摇混匀后瞬时离心（离心机瞬离5秒）至管底。
6.2.2根据样品数目，将PCR扩增试剂按18 μl/管分装于200μl八连排管中，盖好管盖，然后将其转移至PCR扩增区。
在PCR扩增区内加入2 μl模板DNA。
模板DNA包括被测样品DNA（核酸提取管中的上清液）、阳性对照品或者阴性对照品。
此时得到的每份PCR反应体系总体积为20 μl。
建议：每次扩增时均使用阳性对照品和阴性对照品，其中阳性对照品可用于PCR扩增和杂交过程的质控。
阴性对照品可用于监测环境及操作过程中的污染情况6.2.3扩增将离心管或八连排管置于PCR扩增仪中，按（扩增程序选择：TB →MTB→DNA）加热循环程序进行PCR扩增反应。
同时准备冰盒（见4.1.3）6.2.4芯片的准备：在基因微阵列芯片杂交盒的底部加入200 μl蒸馏水（或纯化水，见图1），将托架放入盒体内的两个定位柱之间，将芯片正面向上，小心放在托架上，盖片四个凸台向下盖在芯片上（见图2）。
注意盖片的放置方向，其末端应与芯片末端的标签对齐。
图1：加200μl水湿润底部图2：放置芯片及盖片提示：1.操作应在较清洁的环境中进行，以避免灰尘落在芯片或盖片上，干扰结果判读。
2.不要用任何记号笔在芯片上做标记，否则可能造成芯片背景变脏，影响结果判读。
6.2.5杂交反应混合物的配制、变性及冰浴：1.根据样品数目准备200 μl八连排管并编号。
2.从试剂盒中取出杂交缓冲液，融化后充分混匀，在微量离心机中瞬时离心，按9 μl/管分装。
3. PCR扩增产物95℃加热变性5分钟（置于PCR仪中加热程序），放冰盒冰浴三分钟后，每管加入6 μl相应的PCR扩增产物此时杂交反应混合物为15μl6.2.6杂交反应：将杂交反应混合物从冰浴中取出，用微量移液器吹吸2次混匀，待白色絮状沉淀（如有）消失后，经盖片的加样孔加入13.5 μl 杂交反应混合物（见图4），迅速盖上杂交盒并密封（见图5）。
每个微阵列限加一份样品，记录芯片编号、微阵列位置及对应的样品编号。
立即将密封好的杂交盒水平放入50℃预热的恒温水浴锅中。
待杂交盒全部放入后计时120分钟。
图3：加入杂交反映物图4：杂交盒密封提示：加样过程中应避免加入气泡。
从加样开始至干燥芯片之前的任何一个环节中，均应避免芯片微阵列上的液体长时间直接暴露在空气中，以防干燥造成芯片背景高，干扰结果的判读。
6.2.7芯片洗涤液的准备：根据芯片数量配制芯片洗涤液Ⅰ和芯片洗涤液Ⅱ，体积以洗涤时能够完全浸没芯片为准。
混合均匀并平衡至室温（10-30℃）。
洗涤一次的量为：（洗液一：528ml蒸馏水+66ml20×ssc+12SDS=600ml）(洗液二：990ml水+10ml20×ssc=1000ml)6.2.8芯片的洗涤与干燥: 杂交反应结束后，用洗涤机器进行洗涤后，然后于离心机中800 rpm离心5分钟，甩干后扫描6.2.9芯片扫描和结果判读：使用LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪和相应软件进行信号的读取及结果判读。
操作简介如下（详见扫描仪及软件用户手册）：① 打开扫描仪和相应软件，点击“激光控制”按钮，预热10分钟。
②输入“样品编号”等样品相关信息。
③扫描仪预热完毕后，点击“出仓”按钮，将芯片平稳放置在托架小片上，④水平轻缓地推入扫描仪仓口，点击“入仓”按钮。
⑤输入芯片编号，点击选择检测区域（即微阵列1-4），点击“选择样品”为各微阵列选择相应样品。
点击“开始检测”按钮进行芯片扫描。
结果将在屏幕上显示并自动保存。
⑥一张芯片扫描完毕后重复进行下一张芯片的扫描直至全部扫描完。
⑦可通过“数据查询”页面进行数据查询及打印。
⑧ 完成全部操作后，关闭激光，退出软件，关闭扫描仪。
7 参考值（参考范围）：对于IC（分枝杆菌属）探针和结核分枝杆菌探针通过ROC方法确定其参考值。
对于其他16种非结核分枝杆菌检测探针均通过百分位数法确定其参考值。
当探针信号值大于或等于该探针的参考值，则该探针判读为阳性，当探针信号值小于该探针的参考值，则该探针判读为阴性。
试剂盒中各探针的参考值已经整合到相应判读软件中，由软件自动对样品检测结果进行判别。
8 检验结果的解释：8.1实验质量控制：本试剂盒阳性对照品的检测结果应为“结核分枝杆菌复合群”；阴性对照品的检测结果应为“无分枝杆菌”。
如果其中任何一个对照品结果错误，则同一次实验全部样品结果定为无效，需要进行复检。
8.2 结果判读方法说明：将探针信号值与参考值进行比较，如果探针信号值大于或等于该探针的参考值，则判读为阳性，否则判读为阴性。
然后对所有检测探针按信号值大小进行排序，获取信号值最大的探针8.3 异常结果处理：1）如果只有IC探针阳性，报告为“无法判读”，则需对样品进行复检。
2）如果复检仍为只有IC探针阳性，报告为“无法判读”，则表示该样品不在本试剂盒检测范围内9注意事项9.1操作注意安全防护。
操作致病菌DNA应在规定的实验场所进行，穿戴防护衣物、一次性手套、口罩；所有直接接触过细菌的物品应严格消毒后销毁或再次使用。
9.2本试剂盒对照品为质粒，可质控核酸扩增及杂交环节，不能质控细菌样品制备环节，建议用户自行准备结核菌进行样品制备环节的质控。
9.3有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室的管理规范执行。
PCR扩增应严格按照国家有关规定进行分区，以防止交叉污染。