如何建立HPLC法测定有关物质的方法

即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）
@ @ 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 @ 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应
必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。
药品研究及生产过程中有关物 质的控制方法和要求
上海药检所化学室 谢沐风
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• 有关物质的来源
@ 原料药合成过程中带入; @ 制剂过程中产生;
@ 或是在贮藏、运输、使用过程中产生。
• 控制的必要性
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有关物质的测定方法
仪器角度： @ 高效液相色谱法（HPLC法）、 @ 薄层色谱法（TLC法）、 @ 紫外分光光度法（UV法）、 @ 气相色谱法（GC法）、 @ 毛细管电泳色谱法（CE）等 试验角度： @ 对照品法 @ 自身（稀释）对照法
14.812 15.753
5 10 15 VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112204.D)
15.928
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4 2 0 0 mAU 6 4 2 0 0 5 10
5 10 15 VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112205.D)
此时供试品溶液的浓度可设定为 1mg/ml
~20mg/ml，或者再高一些，但始终需保持主成
分峰不拖尾为准，即不超过最大进样量。
• 拖尾情况也可通过流速进行适当调节
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3. 供试品溶液浓度的确定
浓 度 最大进样量 供试品溶液 对照溶液 最低检出量 50mg/ml 以上 5mg/ml 50μg/ml 1μg/ml
目前USP、BP、EP中的一些规定。
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4 .定量的确定
由于TLC法通常无法准确定量，故可采用 配制一系列浓度的对照溶液来衡量杂质介于何
种浓度之间的方法进行，但此法较为烦琐。
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紫外分光光度法（UV法）
在一些溶液剂的杂质检测中，也常采用在
可见区某波长处测定样品溶液的吸收度值，以
不超过某限度为准的方法。 这里需注意的是，同时需附有溶剂、辅料 （制剂时）的紫外扫描图谱，以验证该法的专 属性。
进样量 20μl 20μl 20μl 20μl
绝对值
相对于样品测定浓度的
100μg 1μg 20ng
100%（5000 倍） 1% 0.02%
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4. 加样回收试验（即准确性试验）
准确性试验可采用样品中加入已知量杂质的
方式来评价。准确称量各杂质，将含有1% (w/w)
浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用 的色谱条件是否可分离检出出相应的各杂质。该 原理同前面所述的专属性研究是一致的。
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有关物质在质量标准中的制订
5。再如：进口的盐酸氨溴索质量标准中规定：
取对照品5mg，加甲醇1ml溶解后，加甲醛1
滴，置60℃加热5分钟，氮气吹干，残渣用
水5ml溶解，再加流动相稀释至25ml，进样
测定，使产生的杂质B（相对保留时间为0.8） 与主成分峰的分离度应大于4.0。
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有关物质在质量标准中的制订
3. 制剂有关物质的检测方法一般应与其原料药有关物质的 检测方法相同。含量测定方法也应尽量与有关物质测定 方法相同，并最好稀释一定倍数。
4. 如分离检测出若干个杂质峰，在制订总杂质限度的基础
上可考虑制订单个杂质限度。
5. 测定制剂时，辅料是否对测定有干扰。如有干扰（通常
试验在各种条件下均可准确进行。该法已在USP、
BP、进口样品和国外药品资料中多次采用。
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有关物质在质量标准中的制订
2. 举例说明： 如： 供试品溶液浓度为0.5mg/ml； 对照溶液浓度为5μg/ml（限度为1.0%） 系统适用性试验用溶液： 对照品溶液浓度为0.5mg/ml； 最难分离杂质对照品浓度为5μg/ml（1.0%）
@ 归一化法
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有关物质的计算方法@源自杂质对照品法@ 加响应因子（即重量校正因子）计算
的自身对照法、 @ 不加响应因子计算的自身对照法 @ 根据不同杂质采用不同方法等。
* 有关物质的计算方法
定量检测和限度检测
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高效液相色谱法（HPLC法）
1 .色谱条件的确定（即专属性试验）
专属性是提供被分析物在杂质和辅料存在
波长——254mn和360nm，故测定有其局限性。
采用显色的方法进行时，通常喷以显色剂后
需立即检视。
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3 . 供试品溶液与对照溶液浓度的确定 （灵敏度试验——最小检出点样量的测定） 其原理与HPLC法相同。
最低检出量可采用不断稀释样品溶液浓度，点样直 至观测不到为止。
最大点样量可采用不断增加样品溶液浓度，直至不 拖尾的浓度为准。 通常考虑到试验耐受性因素的影响，将供试品溶液 浓度设定为比最大点样量略小一些为好。 该项试验要求必须附有试验的点样图谱照片。
时能被区分的证明，通常采用在纯物质（原料
或制剂）中加入一定量的杂质或辅料，证明各
杂质均可与被分析物分离。 配制含有1%(w/w)浓度各中间体（即各杂 质）的主成分对照品溶液作为系统适用性试验 用溶液，来确证色谱条件的适用性。
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专属性试验验证图谱
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2 . 检测波长的确定
涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，
物质，又可检测不具有紫外吸收，因此也被广
泛地应用。但由于其不具有准确定量的性质， 故其应用受到一定的限制。 • 1. 展开剂的确定 与HPLC法相同，配制含有1%浓度各中间 体的主成分对照品溶液作为系统适用性试验用 溶液进行试验，来确证展开剂的适用性。
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2 . 检测方法的确定
可采用紫外灯下检测，由于通常只具有两种
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5. 流速、柱温与溶剂的选择
在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，
且使主成分峰不拖尾即可。
柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚
显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
@ 目前国外有关该项研究的进展
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3. 供试品溶液浓度的确定
（灵敏度试验——最低检出量的测定） • 供试品溶液浓度的设定至关重要。通常其设定 是依据最低检出量和最大进样量来进行的。 • 最低检出量虽然是个绝对值，但其真正的意义 确是其相对值，即相对于供试品溶液中样品浓 度的多少而言。
其测定方法分为直观评价法和依据信躁比两种方法。
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6. 积分参数的设定
积分参数的设定是非常重要的。它主要由斜率 (Slope) 、
峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。
采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同 一斜率、峰宽下进行积分计算。 这里主要是供试品溶液的最小峰面积设定，它将直接 导致测定结果。设定的太小，会导致很多小峰甚至是
最小峰面积。
同时请大家注意，在进行原料药销售与购买的合同中， 为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。
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7. 保留时间的设定
经过上述方法学认证后，确定供试品溶液的 保留时间，通常以洗脱出全部杂质和经强力破坏
试验出的杂质，规定至主成分保留时间的几倍为
止。
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8. 强力破坏试验 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 氧化破坏 强碱破坏 强酸破坏 取原料适量，用 5% 过氧化氢溶液溶解后，在 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 取原料适量，加 1mol/L 盐酸溶液溶解后，在 90℃放置24小时。
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有关物质在质量标准中的制订
3。系统适用性试验进行一强破坏试验，以验 证分离度。如中国药典中的氧氟沙星所有品 种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取 供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4
小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与
主峰的分离度应符合规定。
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有关物质在质量标准中的制订
4。再如：国家药品标准WS1-(X-350)-
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有关物质在质量标准中的制订
1. 通常在原料药的质量标准中，需制订有关物质检 查项。制剂时，如经制剂工艺后，与原料药比较 有关物质有所增加或经稳定性考核后，有关物质 量有所增加，均应在质量标准中制订有关物质检
查项，如未有明显增加，可考虑不予以制订。
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有关物质在质量标准中的制订
2. 质量标准中的系统适用性试验，应规定理论板数 按主成分峰计应不低于多少（通常为2000） ，且 最好能将相应的杂质（该杂质为最难分离的）订入， 以用于系统适用性试验用溶液的配制，将杂质的浓 度配制为主成分浓度的1%进行试验，从而确保本
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10. HPLC/UV二极管阵列检测器
采用二极管阵列检测器进行论证，也是目
前常采用的一个强有力的手段。它通过对一个色
谱峰的几点进行紫外扫描，然后比较所得到的扫
描图谱的接近程度从而评价被检测峰的纯度。
我室有一台该检测器，曾多次做过该方面的 工作。
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薄
层
色
谱
法
薄层色谱法由于既可检测具有紫外吸收的
2004Z——注射用奥美拉唑钠的质量标准中
规定：取供试品溶液，加3%过氧化氢溶液
3ml，放置10分钟后，再加流动相稀释至刻
度，摇匀，作为系统适用性验证用溶液。色 谱图中与主成分峰相邻的氧化降解产物峰与 主成分峰的分离度应符合规定。