蛋白质的水解
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第三章
蛋白质
生工082班
第三章 蛋白质(protein)
蛋白质的概念存在于所 有的生物细胞中，是由 20种α－氨基酸按一定的 序列通过酰胺键（蛋白 质化学中称为肽键）缩 合而成的，具有较稳定 的构象，是构成生物体 最基本的结构物质和功 能物质。相对分子质量
由数千到数千万。
1
第三章 蛋白质(protein)
(123-317页 第3，4，5，6，7章)
第一节 第二节 第三节 第四节
氨基酸—蛋白质的构件分子 蛋白质通论与结构 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的性质、分离与纯化
1
第一节 氨基酸—蛋白质的构件分子
（一）蛋白质的水解
水解类型 使用试剂
优点
H2SO4 (4M) 或
酸水解 HCl (6M),
无消旋作用
完 全
20h
水
碱水解 解 NaOH (5M)
10-20h
色氨酸稳定
缺点
色氨酸被破坏，部分 丝氨酸、苏氨酸水解， 天冬酰胺和谷氨酰胺 脱酰胺基
大多数aa被破坏，有 消旋作用，产物为D和L-氨基酸混合物； 精氨酸脱氨
酶水解 蛋白酶
无消旋作用， 不完全水解，需多种 aa不被破坏 酶协同作用
完全水解：混合的氨基酸 部分水解：肽段和氨基酸
（二）氨基酸的分类
1、根据侧链R基团是否有极性
非极性氨基酸 Ala 、Val、 Ile、 Pro、 Phe、 Trp、 Met
极性氨基酸 不带电极性：Gly Ser Thr Cys Tyr Asn Gln
带负电：Asp Glu
带正电：Lys Arg His
2、根据分子中氨基与羧基数目
酸性氨基酸：Asp Glu
20种组成蛋白质的氨 基酸均为L-型
碱性氨基酸：Lys His Arg
中性氨基酸：15种
3、根据人和哺乳动物所需氨基酸是否能自身合成
必需氨基酸：Lys Val Met Try Leu Ile Thr Phe
半必需：Arg His
非必需：其余10种
不常见的氨基酸：4-羟基脯氨酸 5-羟基赖氨酸 （由常见的氨基酸经修饰而来 的）
非蛋白质氨基酸：150余种
特殊氨基酸的总结
唯一一个无手性碳、无旋光性的氨基酸 ：Gly 唯一一个亚氨基酸、与茚三酮反应生成黄色物质的氨基酸：Pro 含有巯基，在空气中易氧化生成二硫键的氨基酸：Cys 在生物合成中是一种重要甲基供体的氨基酸：Met 在大多数酶的活性中心都发现有其残基的氨基酸：Ser 在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸：His 碱性最强、在生理条件下完全质子化的氨基酸：Arg 含有两个手性碳的氨基酸：Thr Ile 在近紫外区有吸收的氨基酸：Trp Tyr Phe 能够发生Millon反应的氨基酸：Trp 能够发生Pauly反应的氨基酸：His 能够发生坂口反应的氨基酸： Arg
（三）氨基酸的酸碱化学
aa在晶体或水中以兼性离子形式存在
等电点：在溶液某一特定pH值时，氨基酸主要以两性离子形
式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动， 这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。 ➢ 当溶液pH低于该氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之 为负。
➢ 氨基酸在等电点时溶解度最低．不同氨基酸等电点不同．
应用 根据氨基酸的电荷不同（电泳法,离子交换层析）分离混
合物。 根据氨基酸的等电点不同（调节溶液pH ）分离混合物。
Handerson-Hasselbalch公式
pH = pKa + lg（[A-]/ [HA]）= pKa + lg（[碱]/[酸]）
等电点的计算
• 1.侧链不解离的中性氨基酸
•
pI = ( pK1 + pK2 )/2
• 2.侧链含有可解离基团的氨基酸
– 酸性氨基酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 – 碱性氨基酸 pI = ( pK2 + pKR3 )/2 – 半胱氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 – 酪氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2
• 注意：pKa的数值选公式中代入的质子供体和质 子受体之间的解离子数。
（四）氨基酸的化学反应
1.α- 氨基参加的反应 与亚硝酸反应 与酰化试剂反应 烃基化反应 生成西佛碱的反应 脱氨基反应与转氨基反应
2,4－二硝基氟苯 （DNFB或FDNB，Sanger试剂） 苯异硫氰酸酯 （PITC， Edman试剂） 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸及序列测定
2.α-氨基和α-羧基共同参加的反应
• （1）与茚三酮的反应 • （2）氨基酸的两性解离 • （3）形成肽键 • （4）离子交换反应 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离氨基氨
基酸都生成紫色化合物（570）。 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成的是黄色化合物
（440）。 应用：是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。
用层析法把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性测
定各种氨基酸。
3.侧链R基参加的反应
(1)酪氨酸的酚基
➢米伦反应（Millon) 与与浓Hg硝N酸O3作、用H生g（成N黄O色3)2。、HNO3作用呈红色；
➢Pauly反应 与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。 注： His的咪唑基与重氮化合物反应生成棕 红色
（2）精氨酸的胍基
➢坂口反应（Sagakuchi） 与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α-萘酚在氢氧化 钠溶液中产生红色产物。
（3）Cys侧链上的巯基（－SH）
与卤化烷生成稳定的烷基衍生物------可保护 -SH 以防被氧化
Cys巯基打开氮丙啶的环
巯基能和各种金属离子形成络合物----SH 酶遇到 重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活
巯基易受空气或其他氧化剂氧化－两种氧化衍生 物
形成二硫化物：胱氨酸的形成
形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用，保护 Cly巯基之间的氧化。
二硫键的还原（打开） ①氧化剂：过甲酸（HCOOOH）
②还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇 等。
（五）氨基酸的光学活性和光谱性质
氨基酸的旋光性 氨基酸的光谱性质 在280nm处有最大吸收峰 • 可见光区都没有光吸收 • 在远紫外区和红外区都有光吸收 • 近紫外区(220~400nm)只有酪氨酸(275nm)苯丙
氨酸(257nm)和色氨酸(280nm)有吸收。这是紫外 吸收法测定蛋白质含量的基础。
（六）氨基酸混合物的分离和分析
蛋白质
生工082班
第三章 蛋白质(protein)
蛋白质的概念存在于所 有的生物细胞中，是由 20种α－氨基酸按一定的 序列通过酰胺键（蛋白 质化学中称为肽键）缩 合而成的，具有较稳定 的构象，是构成生物体 最基本的结构物质和功 能物质。相对分子质量
由数千到数千万。
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第三章 蛋白质(protein)
(123-317页 第3，4，5，6，7章)
第一节 第二节 第三节 第四节
氨基酸—蛋白质的构件分子 蛋白质通论与结构 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的性质、分离与纯化
1
第一节 氨基酸—蛋白质的构件分子
（一）蛋白质的水解
水解类型 使用试剂
优点
H2SO4 (4M) 或
酸水解 HCl (6M),
无消旋作用
完 全
20h
水
碱水解 解 NaOH (5M)
10-20h
色氨酸稳定
缺点
色氨酸被破坏，部分 丝氨酸、苏氨酸水解， 天冬酰胺和谷氨酰胺 脱酰胺基
大多数aa被破坏，有 消旋作用，产物为D和L-氨基酸混合物； 精氨酸脱氨
酶水解 蛋白酶
无消旋作用， 不完全水解，需多种 aa不被破坏 酶协同作用
完全水解：混合的氨基酸 部分水解：肽段和氨基酸
（二）氨基酸的分类
1、根据侧链R基团是否有极性
非极性氨基酸 Ala 、Val、 Ile、 Pro、 Phe、 Trp、 Met
极性氨基酸 不带电极性：Gly Ser Thr Cys Tyr Asn Gln
带负电：Asp Glu
带正电：Lys Arg His
2、根据分子中氨基与羧基数目
酸性氨基酸：Asp Glu
20种组成蛋白质的氨 基酸均为L-型
碱性氨基酸：Lys His Arg
中性氨基酸：15种
3、根据人和哺乳动物所需氨基酸是否能自身合成
必需氨基酸：Lys Val Met Try Leu Ile Thr Phe
半必需：Arg His
非必需：其余10种
不常见的氨基酸：4-羟基脯氨酸 5-羟基赖氨酸 （由常见的氨基酸经修饰而来 的）
非蛋白质氨基酸：150余种
特殊氨基酸的总结
唯一一个无手性碳、无旋光性的氨基酸 ：Gly 唯一一个亚氨基酸、与茚三酮反应生成黄色物质的氨基酸：Pro 含有巯基，在空气中易氧化生成二硫键的氨基酸：Cys 在生物合成中是一种重要甲基供体的氨基酸：Met 在大多数酶的活性中心都发现有其残基的氨基酸：Ser 在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸：His 碱性最强、在生理条件下完全质子化的氨基酸：Arg 含有两个手性碳的氨基酸：Thr Ile 在近紫外区有吸收的氨基酸：Trp Tyr Phe 能够发生Millon反应的氨基酸：Trp 能够发生Pauly反应的氨基酸：His 能够发生坂口反应的氨基酸： Arg
（三）氨基酸的酸碱化学
aa在晶体或水中以兼性离子形式存在
等电点：在溶液某一特定pH值时，氨基酸主要以两性离子形
式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动， 这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。 ➢ 当溶液pH低于该氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之 为负。
➢ 氨基酸在等电点时溶解度最低．不同氨基酸等电点不同．
应用 根据氨基酸的电荷不同（电泳法,离子交换层析）分离混
合物。 根据氨基酸的等电点不同（调节溶液pH ）分离混合物。
Handerson-Hasselbalch公式
pH = pKa + lg（[A-]/ [HA]）= pKa + lg（[碱]/[酸]）
等电点的计算
• 1.侧链不解离的中性氨基酸
•
pI = ( pK1 + pK2 )/2
• 2.侧链含有可解离基团的氨基酸
– 酸性氨基酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 – 碱性氨基酸 pI = ( pK2 + pKR3 )/2 – 半胱氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 – 酪氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2
• 注意：pKa的数值选公式中代入的质子供体和质 子受体之间的解离子数。
（四）氨基酸的化学反应
1.α- 氨基参加的反应 与亚硝酸反应 与酰化试剂反应 烃基化反应 生成西佛碱的反应 脱氨基反应与转氨基反应
2,4－二硝基氟苯 （DNFB或FDNB，Sanger试剂） 苯异硫氰酸酯 （PITC， Edman试剂） 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸及序列测定
2.α-氨基和α-羧基共同参加的反应
• （1）与茚三酮的反应 • （2）氨基酸的两性解离 • （3）形成肽键 • （4）离子交换反应 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离氨基氨
基酸都生成紫色化合物（570）。 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成的是黄色化合物
（440）。 应用：是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。
用层析法把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性测
定各种氨基酸。
3.侧链R基参加的反应
(1)酪氨酸的酚基
➢米伦反应（Millon) 与与浓Hg硝N酸O3作、用H生g（成N黄O色3)2。、HNO3作用呈红色；
➢Pauly反应 与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。 注： His的咪唑基与重氮化合物反应生成棕 红色
（2）精氨酸的胍基
➢坂口反应（Sagakuchi） 与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α-萘酚在氢氧化 钠溶液中产生红色产物。
（3）Cys侧链上的巯基（－SH）
与卤化烷生成稳定的烷基衍生物------可保护 -SH 以防被氧化
Cys巯基打开氮丙啶的环
巯基能和各种金属离子形成络合物----SH 酶遇到 重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活
巯基易受空气或其他氧化剂氧化－两种氧化衍生 物
形成二硫化物：胱氨酸的形成
形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用，保护 Cly巯基之间的氧化。
二硫键的还原（打开） ①氧化剂：过甲酸（HCOOOH）
②还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇 等。
（五）氨基酸的光学活性和光谱性质
氨基酸的旋光性 氨基酸的光谱性质 在280nm处有最大吸收峰 • 可见光区都没有光吸收 • 在远紫外区和红外区都有光吸收 • 近紫外区(220~400nm)只有酪氨酸(275nm)苯丙
氨酸(257nm)和色氨酸(280nm)有吸收。这是紫外 吸收法测定蛋白质含量的基础。
（六）氨基酸混合物的分离和分析