分子生物学基本研究方法02
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• 然后在第2次分子内反应中，该分子分解成 2个子代分子，其中一个分子就是需要的表 达载体。从而，插入载体中的外源基因亚 克隆到了多个不同的目标载体中，形成各 种不同的表达载体。
优点： • 反应时间短，表达载体生成百分率高。 • 用于构建表达载体非常方便快捷。
酵母单杂交体系 (Yeast One Hybrid system）
• 植物中：
– T-DNA插入失活
A
T-DNA LB
基因组序列
Flanking sequence
LP 300
?
300
RP 300
B
野生型 杂合子 纯合子
900bp
410+？bp
？=0~300
5-13植物基因敲除突变体植株的筛选。A, 引物的设计。LP, RP分 别代表插入基因的左右两端引物，LB是指插入载体上的一段引 物。假定目的基因片断为900bp，Flanking sequence是测序测出的 一段序列。B, PCR电泳结果，分别代表了野生型、杂合子以及纯 合子的条带
克隆 (clone)
• 在多细胞的高等生物个体水平上，表示具 有相同基因型的同一物种的两个或数个个 体组成的群体。同卵双生。
• 细胞水平，由同一个祖细胞分裂而来的一 群遗传上同一的子细胞群体。
• 分子生物学，将外源DNA插入具有复制能力 的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这 种过程。
分离真核生物目的基因片段
分析DNA－蛋白之间的相互作用， 以研究真核细胞内的基因表达调控 。
MBC 4th Edition Fig.9-35
理论基础：
酵母单 杂交体系的酵母 GAL4蛋白是一种典 型的转录因子，将 GAL4 的DNA结合结 构域置换为其他蛋 白，只要它能与我 们想要了解的目的 基因相互作用，就 照样可以通过其转 录激活结构域激活 RNA聚合酶，从而 启动对下游报告基 因的转录。
成功序列数 189 40 42 43 43 42 45 44 43 41 43 615 独立基因数 133 24 25 21 19 16 12 11 8 7 4 280 百分比（%） 70 60 60 49 44 38 26 25 18 17 9
PCR扩增这些基因片段后用机械手点到尼龙 膜上，再以纤维和胚珠RNA为探针进行杂交，分离到 100多个新的纤维特异性或高表达基因（图5-16）。
带突变基因的嵌合体，白色区域 来源于受体胚胎细胞，黑色区域 来源于ES细胞
嵌合体小鼠与白毛纯合体小 鼠回交
黑 色 后 由 ES 细 胞 来 源 的 种 殖 细 胞 （germ-line cell）发育而成，是被破坏 基因X的杂合体
表型分析
5-11基因敲除的技术策略与步骤
• 条件型基因敲除 ：通过定位重组系统实现 特定时间和空间的基因敲除。
基因X的置换载体
neor
tkHSV
被破坏的基因X，两侧与基因X同源
同源重组
+ ES 细胞
非同源重组
基因X 插入靶基因
ES细胞DNA
其它的基因 随机插入
基因X突变
显微注射，将筛选之后的ES 细胞注入早期胚胎的囊胚腔 中，ES细胞是基因X敲除的 杂合体，并且是黒毛纯合 体，早期胚是白毛纯合体
基因X无突变 负选择标记基因表达，致死 将胚胎植入待孕的母亲
• 通过由mRNA产生的cDNA进行克隆。 • cDNA 克 隆 的 基 本 过 程 是 通 过 一 系 列 酶 催 作
用，使总poly（A）mRNA转变成双链cDNA群体 并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌 寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列 的cDNA基因文库。
5.3.1 RACE技术
经典遗传学（Forward genetics） • 从一个突变体的表型出发，研究其基因
型，进而找出该基因的编码序列。
现代遗传学（Reverse genetics） • 首先从基因序列出发，推测其表现型，进
而推导出该基因的功能。
基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因 敲除两种。
• 完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细 胞或动物个体中的靶基因活性。
质粒构建分为2部分：
1) 将文库蛋白片段与GAL4 转录激活域融 合表达的cDNA文库质粒；
2) 含有目的基因和下游报告基因的报告质 粒。
AD 转录因子
顺式元件
顺式元件
顺式元件
Pmin
报道基因
酵母单杂交原理示意图
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报道基因表 达。若连接入3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效 率。
纤维特异性或高表达的基因表达分析
5.3.3基因的大规模（高通量High throughput）克隆技术
后基因组时代的需要推动此技术的产生。
Gateway基因大规模克隆法利用λ噬菌体进 行位点特异性DNA片段重组，不需要传统的酶切 连接过程，基因快速克隆和载体间平行转移， 为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了 有力的技术平台。
Gateway克隆技术主要
A
包括TOPO反应和LR
反应。
• TOPO反应。将通过PCR得到 的目的基因连入Entry载体；
• LR反应。通过位点特异性重 组将目的基因从Entry载体连入 表达载体
B
Gateway 克隆技术小结
• 通路克隆系统的最大特点：可以进行与宿 主无关的克隆/亚克隆。
• 首先，插入克隆与不同目标克隆在特异酶 的识别下，分子内重组形成融合分子；
1993年由冷泉港实验室建立。
原理：
• 利用PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而 仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过 降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头 等方法，特异性扩增目的基因片段。
举例:选用开花后10天、棉花纤维伸长速度最快 的陆地棉纤维及无长绒无短绒突变体胚珠作为起始 材料，用改良的cDNA差示分析法筛选纤维伸长相关 基因。
5.2.4 SNP技术及应用
概念： Single Nucleotide Polymorphism，
SNP，单核苷酸多态性。指基因组DNA序列中 由于单个核苷酸（A,T,C和G）的突变引起的 多态性变异。
一个SNP表示在基因组某各位点上有一 个核苷酸的变化。
源于单个碱基的转换或颠换。转换占 2/3左右，在CG序列上出现较多，多是C转 换为T.
3’polyA 尾
AAAAAAA
去磷酸化
3’polyA 尾
AAAAAAA
去掉帽子结构, 加寡聚接头
RNA 连 接酶连接
AAAAAAA
3’polyA 尾
3’polyA 尾
AAAAAAA
2. 去磷酸化作用。带帽子结构的 mRNA不受影响。
3. 去掉mRNA的5’ 帽子结构，加特异 性RNA 寡聚接头并用RNA 连接酶 相连接。
Gene knock-in
1985年，利用同源重组将一段外源质 粒p∆β117插入到人类染色体DNA β-珠蛋白 位点，首次在哺乳动物细胞中进行基因打 靶并获得成功。
在胚胎干细胞中进行同源重组已经成 为遗传修饰小鼠染色体组基因位点的常规 技术。
gene knock-out/ knock-in的特点：
4. 以特异性寡聚dT为引物，在反转录酶 的作用下，反转录合成第一条cDNA 链。
5. 分别以第一链cDNA为模板进行 RACE反应。
5’ 引物 cDNA第一链
cDNA第一链 5’ RACE
TTTTTTT-(N)36
Oligo dT 引物
反转录酶作
用
3’RACE
TTTTTTT反向基因 (N)36
特异引物
（rapid amplification of cDNA ends）
在已知cDNA 序列的基础上克隆5’端或3’ 端缺失序列的技术。
该方法Frohman等人1988年第一次提出．
已知cDNA序列来源： • 来自序列表达标签(EST)，减法cDNA库，差
式显示和基因文库筛选。 应用： • 获得全长cDNA，还用于识别5’和3’端非转
序列分析
6. 将纯化后的 PCR产物克隆到载体 DNA中，进行序列分析。
cDNA差示分析法（Representational Difference Analysis，RDA）
A technique to find differences in two genomic or cDNA samples. Genomics or cDNA sequences from two samples are PCR amplified and differences analyzed using subtractive DNA hybridization.
用途：
寻找和研究SNP有助于解释个体的表型 差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复 杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性 和对环境因子的反应。是人类基因组计划 的内容和目标之一。
法 医 学 应 用 举 例
SNP
在 未 来 医 生 开 处 方 中 的 应 用
5.2.5 基因敲除技术
概念：
• gene knock-out,又称基因打靶。通过外 源DNA与染色体DNA之间的同源重组，精确 的定点修饰和改造基因。
克隆、测 序
正向基因特异引 物
cDNA第一链
TTTTTTT-(N)36
3’ 引物
克隆、测 序
TTTTTTT-
(N)36 AAAAAA-
(N)36
5’RACE 以5’端RNA寡聚接头的部 分序列和基因特异的3’端反向引物 进行PCR扩增，获得基因的5’端序 列。
3’RACE以5’端基因特异的引物和3’ 端寡聚dT下游部分序列为引物进行 PCR 扩增，获得基因的3’ 端序列。 如果只对3’端序列感兴趣，可以越 过2，3两步，直接从第4步开始进行 3’RACE。
录序列，研究转录起始位点的不均一性， 研究启动子区的保守性。
高质量总RNA的获得
1. 获得高质量总RNA。
5’帽子结构
mRNA m7G-p-p不p 完整mRNA PO4 非mRNA PO4
mRNA m7G-p-p不p 完整 mRNA 非mRNA
5’ 3’ OH PO4
RNA寡聚体 5’ RNA 寡聚体
Arabidopsis cDNA inserts
PADH1
GAL4 AD
TADH1
转化
LEU2
酵母转化体
DRE
DR
DR
DRE
Pmin
E
E
Lຫໍສະໝຸດ BaiducZ
URA3
筛 选 挑取阳性克隆
测序，进一步验证结合活性
阳性克隆（蓝色菌落）
从拟南芥 cDNA文库中 筛选与顺式 元件DRE结合 的转录因子 示意图
At1g30210编码蛋白的激活活 性鉴定（酵母显色） 1. 空载体pYF503+pG222，菌 落为白色 2. pYF504(Gal4全 长)+pG222，菌落为蓝色 3. At1g53230 in pYF503+pG222，菌落为白色 4. At1g30210 in pYF503+pG222，菌落为蓝色 5. At1g30210 in pYF503+切 去Gal4 Cis 的pG222，菌落为 白色 6. Ubiquitin in pYF503＋ pG222， 菌落为白色
在人类基因组中，SNP 变异频率大于1 %, 每300∼1000 个碱基对就有一个SNP ,一 个人至少携带3 00万个SNPs。
SSCP Analysis: Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis
A. SSCP原理模式图 依据原理：单链DNA分子采用序列特异的构象。由单碱基替代引起的构象 改变，可通过检测其在非变性聚丙烯酰胺胶中的迁移率的变化而捡出。
首先用PCR-Select cDNA Subtraction方法获 得纤维特异的cDNA减法库，每次随机挑取50个克隆 测序，经14组700个序列分析表明该减法库中最多 包含280-300个独立基因（表5-2）。
cDNA减法库随机序列分析结果
分组
1-4 5 6 7
8
9 10 11 12 13 14 总数
• 位点专一性强，打靶后目的片段可以与染 色体DNA共同稳定遗传。
5.3 基因克隆技术简介
• 5.3.1 RACE 技术 • 5.3.2 应用cDNA差示分析法克隆基因 • 5.3.3 基因大规模克隆技术 • 5.3.4 酵母单杂交法 • 5.3.5 酵母双杂交系统 • 5.3.6 基因的图位克隆法
– Cre/LoxP系统
• Cre is a 38 kDa recombinase protein from bacteriophage P1 which mediates intramolecular (excisive or inversional) and intermolecular (integrative) site specific recombination between loxP sites
优点： • 反应时间短，表达载体生成百分率高。 • 用于构建表达载体非常方便快捷。
酵母单杂交体系 (Yeast One Hybrid system）
• 植物中：
– T-DNA插入失活
A
T-DNA LB
基因组序列
Flanking sequence
LP 300
?
300
RP 300
B
野生型 杂合子 纯合子
900bp
410+？bp
？=0~300
5-13植物基因敲除突变体植株的筛选。A, 引物的设计。LP, RP分 别代表插入基因的左右两端引物，LB是指插入载体上的一段引 物。假定目的基因片断为900bp，Flanking sequence是测序测出的 一段序列。B, PCR电泳结果，分别代表了野生型、杂合子以及纯 合子的条带
克隆 (clone)
• 在多细胞的高等生物个体水平上，表示具 有相同基因型的同一物种的两个或数个个 体组成的群体。同卵双生。
• 细胞水平，由同一个祖细胞分裂而来的一 群遗传上同一的子细胞群体。
• 分子生物学，将外源DNA插入具有复制能力 的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这 种过程。
分离真核生物目的基因片段
分析DNA－蛋白之间的相互作用， 以研究真核细胞内的基因表达调控 。
MBC 4th Edition Fig.9-35
理论基础：
酵母单 杂交体系的酵母 GAL4蛋白是一种典 型的转录因子，将 GAL4 的DNA结合结 构域置换为其他蛋 白，只要它能与我 们想要了解的目的 基因相互作用，就 照样可以通过其转 录激活结构域激活 RNA聚合酶，从而 启动对下游报告基 因的转录。
成功序列数 189 40 42 43 43 42 45 44 43 41 43 615 独立基因数 133 24 25 21 19 16 12 11 8 7 4 280 百分比（%） 70 60 60 49 44 38 26 25 18 17 9
PCR扩增这些基因片段后用机械手点到尼龙 膜上，再以纤维和胚珠RNA为探针进行杂交，分离到 100多个新的纤维特异性或高表达基因（图5-16）。
带突变基因的嵌合体，白色区域 来源于受体胚胎细胞，黑色区域 来源于ES细胞
嵌合体小鼠与白毛纯合体小 鼠回交
黑 色 后 由 ES 细 胞 来 源 的 种 殖 细 胞 （germ-line cell）发育而成，是被破坏 基因X的杂合体
表型分析
5-11基因敲除的技术策略与步骤
• 条件型基因敲除 ：通过定位重组系统实现 特定时间和空间的基因敲除。
基因X的置换载体
neor
tkHSV
被破坏的基因X，两侧与基因X同源
同源重组
+ ES 细胞
非同源重组
基因X 插入靶基因
ES细胞DNA
其它的基因 随机插入
基因X突变
显微注射，将筛选之后的ES 细胞注入早期胚胎的囊胚腔 中，ES细胞是基因X敲除的 杂合体，并且是黒毛纯合 体，早期胚是白毛纯合体
基因X无突变 负选择标记基因表达，致死 将胚胎植入待孕的母亲
• 通过由mRNA产生的cDNA进行克隆。 • cDNA 克 隆 的 基 本 过 程 是 通 过 一 系 列 酶 催 作
用，使总poly（A）mRNA转变成双链cDNA群体 并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌 寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列 的cDNA基因文库。
5.3.1 RACE技术
经典遗传学（Forward genetics） • 从一个突变体的表型出发，研究其基因
型，进而找出该基因的编码序列。
现代遗传学（Reverse genetics） • 首先从基因序列出发，推测其表现型，进
而推导出该基因的功能。
基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因 敲除两种。
• 完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细 胞或动物个体中的靶基因活性。
质粒构建分为2部分：
1) 将文库蛋白片段与GAL4 转录激活域融 合表达的cDNA文库质粒；
2) 含有目的基因和下游报告基因的报告质 粒。
AD 转录因子
顺式元件
顺式元件
顺式元件
Pmin
报道基因
酵母单杂交原理示意图
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报道基因表 达。若连接入3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效 率。
纤维特异性或高表达的基因表达分析
5.3.3基因的大规模（高通量High throughput）克隆技术
后基因组时代的需要推动此技术的产生。
Gateway基因大规模克隆法利用λ噬菌体进 行位点特异性DNA片段重组，不需要传统的酶切 连接过程，基因快速克隆和载体间平行转移， 为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了 有力的技术平台。
Gateway克隆技术主要
A
包括TOPO反应和LR
反应。
• TOPO反应。将通过PCR得到 的目的基因连入Entry载体；
• LR反应。通过位点特异性重 组将目的基因从Entry载体连入 表达载体
B
Gateway 克隆技术小结
• 通路克隆系统的最大特点：可以进行与宿 主无关的克隆/亚克隆。
• 首先，插入克隆与不同目标克隆在特异酶 的识别下，分子内重组形成融合分子；
1993年由冷泉港实验室建立。
原理：
• 利用PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而 仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过 降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头 等方法，特异性扩增目的基因片段。
举例:选用开花后10天、棉花纤维伸长速度最快 的陆地棉纤维及无长绒无短绒突变体胚珠作为起始 材料，用改良的cDNA差示分析法筛选纤维伸长相关 基因。
5.2.4 SNP技术及应用
概念： Single Nucleotide Polymorphism，
SNP，单核苷酸多态性。指基因组DNA序列中 由于单个核苷酸（A,T,C和G）的突变引起的 多态性变异。
一个SNP表示在基因组某各位点上有一 个核苷酸的变化。
源于单个碱基的转换或颠换。转换占 2/3左右，在CG序列上出现较多，多是C转 换为T.
3’polyA 尾
AAAAAAA
去磷酸化
3’polyA 尾
AAAAAAA
去掉帽子结构, 加寡聚接头
RNA 连 接酶连接
AAAAAAA
3’polyA 尾
3’polyA 尾
AAAAAAA
2. 去磷酸化作用。带帽子结构的 mRNA不受影响。
3. 去掉mRNA的5’ 帽子结构，加特异 性RNA 寡聚接头并用RNA 连接酶 相连接。
Gene knock-in
1985年，利用同源重组将一段外源质 粒p∆β117插入到人类染色体DNA β-珠蛋白 位点，首次在哺乳动物细胞中进行基因打 靶并获得成功。
在胚胎干细胞中进行同源重组已经成 为遗传修饰小鼠染色体组基因位点的常规 技术。
gene knock-out/ knock-in的特点：
4. 以特异性寡聚dT为引物，在反转录酶 的作用下，反转录合成第一条cDNA 链。
5. 分别以第一链cDNA为模板进行 RACE反应。
5’ 引物 cDNA第一链
cDNA第一链 5’ RACE
TTTTTTT-(N)36
Oligo dT 引物
反转录酶作
用
3’RACE
TTTTTTT反向基因 (N)36
特异引物
（rapid amplification of cDNA ends）
在已知cDNA 序列的基础上克隆5’端或3’ 端缺失序列的技术。
该方法Frohman等人1988年第一次提出．
已知cDNA序列来源： • 来自序列表达标签(EST)，减法cDNA库，差
式显示和基因文库筛选。 应用： • 获得全长cDNA，还用于识别5’和3’端非转
序列分析
6. 将纯化后的 PCR产物克隆到载体 DNA中，进行序列分析。
cDNA差示分析法（Representational Difference Analysis，RDA）
A technique to find differences in two genomic or cDNA samples. Genomics or cDNA sequences from two samples are PCR amplified and differences analyzed using subtractive DNA hybridization.
用途：
寻找和研究SNP有助于解释个体的表型 差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复 杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性 和对环境因子的反应。是人类基因组计划 的内容和目标之一。
法 医 学 应 用 举 例
SNP
在 未 来 医 生 开 处 方 中 的 应 用
5.2.5 基因敲除技术
概念：
• gene knock-out,又称基因打靶。通过外 源DNA与染色体DNA之间的同源重组，精确 的定点修饰和改造基因。
克隆、测 序
正向基因特异引 物
cDNA第一链
TTTTTTT-(N)36
3’ 引物
克隆、测 序
TTTTTTT-
(N)36 AAAAAA-
(N)36
5’RACE 以5’端RNA寡聚接头的部 分序列和基因特异的3’端反向引物 进行PCR扩增，获得基因的5’端序 列。
3’RACE以5’端基因特异的引物和3’ 端寡聚dT下游部分序列为引物进行 PCR 扩增，获得基因的3’ 端序列。 如果只对3’端序列感兴趣，可以越 过2，3两步，直接从第4步开始进行 3’RACE。
录序列，研究转录起始位点的不均一性， 研究启动子区的保守性。
高质量总RNA的获得
1. 获得高质量总RNA。
5’帽子结构
mRNA m7G-p-p不p 完整mRNA PO4 非mRNA PO4
mRNA m7G-p-p不p 完整 mRNA 非mRNA
5’ 3’ OH PO4
RNA寡聚体 5’ RNA 寡聚体
Arabidopsis cDNA inserts
PADH1
GAL4 AD
TADH1
转化
LEU2
酵母转化体
DRE
DR
DR
DRE
Pmin
E
E
Lຫໍສະໝຸດ BaiducZ
URA3
筛 选 挑取阳性克隆
测序，进一步验证结合活性
阳性克隆（蓝色菌落）
从拟南芥 cDNA文库中 筛选与顺式 元件DRE结合 的转录因子 示意图
At1g30210编码蛋白的激活活 性鉴定（酵母显色） 1. 空载体pYF503+pG222，菌 落为白色 2. pYF504(Gal4全 长)+pG222，菌落为蓝色 3. At1g53230 in pYF503+pG222，菌落为白色 4. At1g30210 in pYF503+pG222，菌落为蓝色 5. At1g30210 in pYF503+切 去Gal4 Cis 的pG222，菌落为 白色 6. Ubiquitin in pYF503＋ pG222， 菌落为白色
在人类基因组中，SNP 变异频率大于1 %, 每300∼1000 个碱基对就有一个SNP ,一 个人至少携带3 00万个SNPs。
SSCP Analysis: Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis
A. SSCP原理模式图 依据原理：单链DNA分子采用序列特异的构象。由单碱基替代引起的构象 改变，可通过检测其在非变性聚丙烯酰胺胶中的迁移率的变化而捡出。
首先用PCR-Select cDNA Subtraction方法获 得纤维特异的cDNA减法库，每次随机挑取50个克隆 测序，经14组700个序列分析表明该减法库中最多 包含280-300个独立基因（表5-2）。
cDNA减法库随机序列分析结果
分组
1-4 5 6 7
8
9 10 11 12 13 14 总数
• 位点专一性强，打靶后目的片段可以与染 色体DNA共同稳定遗传。
5.3 基因克隆技术简介
• 5.3.1 RACE 技术 • 5.3.2 应用cDNA差示分析法克隆基因 • 5.3.3 基因大规模克隆技术 • 5.3.4 酵母单杂交法 • 5.3.5 酵母双杂交系统 • 5.3.6 基因的图位克隆法
– Cre/LoxP系统
• Cre is a 38 kDa recombinase protein from bacteriophage P1 which mediates intramolecular (excisive or inversional) and intermolecular (integrative) site specific recombination between loxP sites