磷酸酶活性测定

磷酸酶活性测定

磷酸酶可催化磷酸脂类或磷酸酐的水解,其活性的高低直接影响着土壤有机磷的分解转化及其生物有效性(耿玉清等，2008)。土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，可作为反映土壤磷素水平的一项生物指标（于群英，2001）。

测定方法: 磷酸苯二钠比色法

1. 试剂配制

（1） pH9.8氯化铵―氢氧化铵缓冲液100mL：取20g纯氯化铵，溶于100mL浓氢氧化铵中。

（2） 8%铁氰化钾液100mL:取8g铁氰化钾，溶于蒸馏水中，稀释至100mL(此液只能用一周)。

（3） 2% 4-氨基氨替比林液100mL:取2g 4-氨基氨替比林溶于水中，稀释至100mL(此液只能用一周)。

（4） 0.5%磷酸苯二钠溶液500mL:取2.5g磷酸苯二钠溶于水中，稀释至500mL。（5）酚的标准溶液：酚原液：取1g重蒸酚（phenol,又名石碳酸）溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。

酚工作液：取10mL酚原液稀释至1L（每mL含0.01mg酚）。

（6）甲苯。

2. 操作步骤

（1）标准曲线绘制：取1，3，5，7，9，11，13mL酚工作液置于50mL容量瓶中，另取一管做空白对照，分别加入20mL蒸馏水。再加入0.25mL缓冲液、0.5mL 4-氨基氨替比林液，0.5mL铁氰化钾液。每次加入试剂要充分摇动，最后定容至50mL。在15min内，在分光光度计上于510nm处比色测定溶液的光密度。最后绘成标准曲线。

（2）土壤磷酸酶活性测定：称5.00g风干土样，置于50mL三角瓶中，加5滴甲苯后再加入20mL0.5%磷酸苯二钠,充分振荡后于37℃恒温箱中培养2h。取培养后的滤液5mL，按标准曲线所述方法显色，比色测定。

土壤样品酶活性测定分三次进行：新鲜土样测量一次，风干后测量一次，风干土样保存1个月后再测量一次。

3. 结果计算

磷酸酶活性，以2h后100g土壤中P2O5的毫克数表示。

P2O5（mg）= a×80×0.32×2.29

式中 a----从标准曲线查的酚的mg数（5ml滤液中酚的毫克数）；

80----换算成100g土壤的系数；

0.32-----以磷为单位表示结果的系数（在磷酸苯二钠中，1个重量单位的酚，相当于0.32重量单位的磷）；

2.29-----将P换算成 P2O5的系数。

（用2,6－双溴苯醌氯酰亚胺作显色剂测定土壤磷酸酶活性时，要现用现配，用2.5％的铁氰化钾和用0.5％的4－氨基安替吡啉作显色剂测定土壤磷酸酶活性时，最多不要超过3d。2.5％的铁氰化钾和0.5％的4－氨基安替吡啉代替2,6－双溴苯醌氯酰亚胺作显色剂测定磷酸酶活性，测定结果不受影响。）

（系列缓冲溶液配制方法：关松荫．土壤酶及其研究法［M］．北京：农业出版社，1987．）

(夏栋等（2011年）研究土壤磷酸酶测定中不同缓冲溶液对吸收波长的影响时得出结论，建议在土壤磷酸酶测定过程中，吸取土壤滤液显色时，加一定体积的缓冲溶液的pH 选择 9.0（硼酸缓冲溶液）“大于8显色速度快”，同时选择可见光区604 nm 波长的光作为光源。“紫外光区最大吸收波长不一致”)