发光细菌实验方案
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一:准备工作
需消毒:①培养皿12个②移液管③试管12个④接种环2个⑤三角玻棒(暂无)⑥锥形瓶6个(暂无)⑦玻璃棒2个
仪器不需消毒:①灭菌锅(暂无)②恒温培养箱(暂无)③电子显微镜(暂无)④振荡器(暂无)⑤电炉(不可用)⑥离心机(暂无)⑦电子天平⑧酒精灯2
个(暂无)⑨牛皮纸⑩剪刀⑪pH计⑫棉花⑬火柴(暂无)
试剂:①蛋白胨②牛肉膏③琼脂粉④无菌水⑤甘油(丙三醇)⑥人工海水(调pH7.4~7.8)(无机成分:NaCl400mmol/L,MgSO4·7H2O 100mmol/L,KCl 20mmol/L,CaCl2·2H2O 20mmol/L,必须分别溶解后再混合;有机成分质量分数:0.3%的甘油,0.5%酵母膏,0.5%胰蛋白胨,再加入0.1%CaCO3。)
培养过程的特殊需求(均为暂无):0.25μm~0.45μm硝基纤维滤膜(方法三过滤),铁架台和漏斗(方法三过滤),不透光的黑布(方法二),磷酸高铁(方法二陪简易培养基)
提取过程的特殊需求(均为暂无):手电筒,半透明红纸
二:培养
方法一:直接将鱿鱼/内脏剪碎,放于无菌水中震荡,取浸出液在普通固体培养基(就是我们已经配好还没溶解的那个)的培养皿上划线分离或涂布分离,在恒温培养箱中培育2~3天。
方法二:将鱿鱼/内脏剪碎,在2216E培养基(简易制法:蛋白胨5g,酵母粉1g,琼脂粉15g,磷酸高铁0.01g,用在黑暗环境下放置2~3天的人工海水加至1000ml,调pH为7.6~7.8)中置于暗室(我觉得盖上不透光的黑布就行)培育3~4天,然后在倒有普通固体培养基的培养皿上划线分离或涂布分离,在恒温培养箱中培育2~3天。
方法三:将鱿鱼/内脏剪碎丢入无菌水中震荡,静置后用移液管取上层溶液用硝基纤维滤膜过滤,之后直接将硝基纤维滤膜铺在普通固体培养基上进行培养,在恒温培养箱中培育2~3天。
P.S.2216E培养基完整成分:蛋白胨5g,酵母粉1g,琼脂粉15g,磷酸高铁0.01g,NaCl 19.45g,KCl 0.55g,CaCl2 1.8g,MgCl2 5.98g,Na2SO4 3.24g,Na2CO3 0.16g,KBr 0.68g
三:提取
方法一:在暗室中用肉眼观察是否有蓝绿色光点,用灭过菌(一般是用酒精灯火焰灼烧至发红再冷却)的接种环,轻轻接触到该光点(不能触及不发光的地方),立即在另一个培养皿中划线,然后置于室温(至少10℃以上)培养14~16h。在暗室中观察是否有单个发光点,
应选择发光良好,外形圆整的单个菌落。再次用接种针轻轻接触到这个单菌落光点,重新划线培养。经如此三四次划线分离后,可将单菌落转接到斜面中保存,并给予编号。
方法二:讲肉眼观察蓝绿色光点改为用套上红纸的手电筒照射,寻找灰白色菌落,其余不变。P.S.良好的菌落透明白色或无色,中间凸起呈馒头状,发出淡淡的蓝绿光
四:鉴定
方法一:直接用肉眼观察是否发出蓝绿色的光。
方法二:用分光光度计(我不是很清楚要怎么测,所以就不详细写了)测量发出的光波长是否在450nm~550nm之间。
方法三:用革兰氏试剂染色后镜检看是否为红色(这个我也不是很清楚要怎么测,所以也不详细写了)。
五:后续发散
1.检验食物毒性。
2.检验水体的污染程度、毒性大小,以及水质是否可用。
3.检验大气的污染程度。
方法:将培育出的发光细菌分散为多个培养基,用控制变量法设置多个实验对照组,配置不同毒性或不同污染程度的水或不同浑浊程度的空气分别与发光细菌混合,细菌的发光强度可以反映出发光细菌的生活特性,从而画出发光强度与毒性或污染程度曲线,最终确定线性关系参数。
发散:用细胞固化技术将发光细菌固定,利用高灵敏的桂光二极管测量发光细菌的发光强度,由线性关系将发光细菌发光强度转化为具体的毒性强弱或水体污染程度或大气污染程度。
P.S.2216E培养基完整成分:蛋白胨5g,酵母粉1g,琼脂粉15g,磷酸高铁0.01g,NaCl 19.45g,KCl 0.55g,CaCl2 1.8g,MgCl2 5.98g,Na2SO4 3.24g,Na2CO3 0.16g,KBr 0.68g