[课件]环介导等温扩增技术原理PPT
第8章环介导等温扩增
扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。
lamp环介导等温扩增原理
lamp环介导等温扩增原理
LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的等温扩增技术，它可以在恒定温度下快速扩增DNA序列，因此被广泛应用于分子生物学和医学领域。
LAMP技术的原理如下：
1.引物设计
LAMP技术需要设计4-6个特异性引物，其中包括两个外部引物（F3和B3），两个内部引物（FIP和BIP）和一个环形引物（loop primer）。
这些引物的设计基于目标DNA序列的特异性，以及引物之间的相互作用，以确保扩增的特异性和高效性。
2.等温扩增
LAMP技术的扩增过程是在恒定温度下进行的，一般为60-65℃。
引物结合到目标DNA序列上后，FIP和BIP引物通过自身的反向和正向扩增，形成一个DNA 环，这个环可以作为模板，引导F3和B3引物的扩增。
同时，环形引物也可以加速扩增速度和提高扩增效率。
3.产物检测
LAMP技术的产物是大量的DNA片段，可以通过凝胶电泳或实时荧光检测来进行检测。
实时荧光检测可以在扩增过程中实时监测DNA量的增加，从而确定扩增的特异性和灵敏度。
总之，LAMP技术是一种快速、特异性和高效的等温扩增技术，可以广泛应用于分子生物学和医学领域，例如病原体检测、基因突变分析和DNA测序等。
环介导等温扩增技术
谢谢欣赏！
采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
环介导等温扩增技术简介
哑铃状模板构造形成的过程
（1）
FIP
（2）
（3）
F3 Primer
（4） （5）
＋
解离链
（6） 环状结构
BIP
（7）
（8）
＋
解离链
环状结构
B3 Primer
环状结构
循环扩增阶段和延伸循环阶段
环介导等温扩增反应的体系
环介导等温扩增法所需的试剂
DNA扩增
RNA扩增
模板DNA 引物
FIP F3 BIP B3 链置换型DNA聚合酶
dNTPs 反应缓冲液
模板DNA
引物 FIP F3 BIP B3
链置换型DNA聚合酶 逆转录酶 dNTPs 反应缓冲液
PS：当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。
环介导等温扩增有哪些优点？
优点
不需要使双链DNA先变性成单链，省时。 扩增反应在等温下可持续进行。 扩增的效率极高。 针对6个区段使用4种引物，拥有高度的特异性。 不需要PCR仪器，仅仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本 低廉。 扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不 一的片段，检测方法简单。
环介导等温扩增的特征是针对目标DNA链上的6个区段设 计4个不同的引物然后再利用链置换型DNA合成酶在一定温度 下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合 成酶、基质等共同置于一定温度下（60-65℃），经一个步骤 即可完成。其扩增效率极高，可在15~60min内实现109~1010 倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需很据扩增产物的 有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。
环介导等温扩增技术
１．ＬＡＭＰ法检测结果：应用实时荧光定量方法 检测，测定出的痰标本中细菌浓度分别以１×１０３拷 贝／ｍｌ和１×１０５拷贝／ｍｌ为界值，计算每个界值范 围内阳性结果的例数，具体数据见表１。
中社区获得性肺炎１７４例，慢性阻塞性肺疾病急性
加重６０例，支气管扩张伴感染４３例，慢性支气管炎
急性发作８例，医院获得性肺炎４例。人选患者均
测出病原菌１８５株，其中细菌１４４株，非典型病原菌 ４１株；革兰阴性杆菌１２２株，革兰阳性球菌２２株。 革兰阴性杆菌中致病菌依次为铜绿假单胞菌４０株 （２１．６％），流感嗜血杆菌３４株（１８．４％），肺炎克雷 伯菌２０株（１０．８％），嗜麦芽窄食单胞菌１２株 （６．５％），鲍曼不动杆菌１１株（５．９％），大肠埃希菌 ５株（２．７％）。非典型病原菌中肺炎支原体３９株
ｗｅｒｅ
ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
ａ
ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ２８９ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４４（１５．２％）ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｔｅｓｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ＞１×１０３ ｅｏｐｉｅｓ／ｍｌ ａｓ ｃｕｔｏｆｆ ｖａｌｕｅ．ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
痰标本中的细菌浓度（拷贝／ｍ１）＝模板浓度
（拷贝／斗１）×１００／０．６。以细菌浓度＞１×１０３拷贝／ ｍ１判定为阳性结果ｐ ｏ。 ４．统计学处理：结果数据均采用ＳＰＳＳ １７．０统 计软件分析。配对的计数资料之间两两比较采用
ＭｃＮｅｍａｒ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术，以其
特异度强、敏感度高、快速准确和操作简单、技术水 平要求相对较低及所需试验器材简单等优点被广泛 应用于生物学的各个领域，可被推广用于感染性疾
LAMP
LAMP（环介导等温扩增）技术2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。
然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。
通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。
LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。
目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。
详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍：LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。
环介导等温扩增技术原理课堂PPT
基 础 结 构
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LAMP
环介导的等温扩增技术原理
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环介导等温扩增过程演示
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反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively :lane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
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各类等温扩增技术的比较
温度 ℃ 引物
模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
DNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C 和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
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环介导等温扩增原理
LAMP技术原理和引物设计
LAMP技术原理和引物设计LAMP技术（Loop-mediated isothermal amplification），中文称为环介导等温扩增技术，是一种于2000年由Eiken Chemical Co. Ltd.日本公司开发的基于异十四链聚合酶反应（Bst聚合酶）的异源DNA快速扩增技术。
LAMP技术通过引物设计和反应条件的优化，实现在等温条件下对目标DNA的高效扩增。
下面将分别介绍LAMP技术的原理和引物设计。
LAMP技术的核心原理是通过酶的协同作用，在等温条件下进行DNA的扩增。
它利用一种特殊的DNA聚合酶（Bst聚合酶），能够在不需要高温退火的情况下，具有高度特异性和高效率地进行DNA合成。
LAMP技术本身具有极高的扩增速度，优势在于其在等温下，不需要复杂的设备和严格的实验条件，可以简化扩增过程。
同时采用特殊设计的引物组合，能够提高扩增特异性。
1.初始化反应：将反应体系中的DNA片段与引物（包括2个外端引物和2个补体引物）结合；2. 引物扩增：引物与Bst聚合酶作用，反应体系中的DNA得到扩增；3.聚合物合成：一种特殊的引物结合到目标DNA的5'末端，通过内端引物和内部位点进行扩增；4.循环放大：扩增产物作为新的模板参与反应，进行连续循环扩增。
通过这种等温扩增的方法，LAMP技术可以在短时间内获得大量的目标DNA，且具有很高的扩增特异性和灵敏度，可以用于分子生物学、诊断医学和病原检测等领域。
引物设计：引物设计是LAMP技术成功应用的重要因素之一、LAMP技术使用了4个单链引物，包括2个外端引物（forward outer primer，F3和reverse outer primer，B3）和2个内端引物（forward inner primer，FIP和reverse inner primer，BIP）。
外端引物负责扩增DNA的初始段，内端引物负责扩增DNA的中间段。
在引物设计中，需要注意以下几个方面：1.引物的特异性：要求引物能够有高度特异地结合到目标DNA的区域，确保扩增的目标是准确的；2.引物的长度和碱基组成：引物的长度通常为20-24个碱基，碱基组成要尽量避免重复序列和形成组内结构，以保证扩增效率和特异性；3.引物的位置和方向：合理选择引物的位置和方向，以确保扩增产物的特异性和有效性；4.引物的浓度：引物的浓度需要进行优化，以获得最佳的扩增效果。
Loop-mediated isothermal amplification 环介导等温扩增技术
样本前处理
• 简化样本提取DNA/RNA步骤 煮沸法、抽提液、自动化提取……
应用
• RT-LAMP：1步法，逆转录和扩增同时进行 • 原位LAMP • LAMP在核酸测序、SNP分型、DNA/PRO芯片有广泛 应用前景。 • 日本Eiken公司已开发包括禽流感、SARS、西尼罗河 病毒、牛胚胎性别检测等19种LAMP产品出售。 • 我国有20几种LAMP试剂盒申请了专利，但没有一个 通过FDA、SFDA认证。 • 在中国，产品主要覆盖猪、禽、结核、支原体、衣 原体、嗜血杆菌等。
LAMP的特点
• 特异性强：受非靶序列的影响小。 • 灵敏度高：与PCR相比，其检测极限更小，仅为几个拷贝。 • 等温高效：LAMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造 成时间的损失。耗时短。若再增加一对环引物，扩增时间能 缩短到30min内。 • 产物易检测，操作简便，反应不需PCR仪。 • 稳定性、精密度均符合试剂盒（研发）要求。 • 一次只能检测一个病原 • 引物设计比传统的PCR复杂，须用专业软件设计（免费）。 在200bp片段内选择6个设计区域，引物筛选周期2-3个月。 引物特异性 • 产物鉴定麻烦，需开管酶切，仅日本拥有LAMP产物测序技 术？ • Cutoff值，检测仪器LA-320C实时浊度仪
扩增效率：107
原 理
温度 60~65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右 处于松散的动态平衡状态。 酶 Bst DNA大片段聚合酶，能在引物配对双链DNA的互补部位进 行延伸扩增，同时将另一条链解离，变成单链。 引物 利用4条特异引物使链置换DNA合成在不停地自我循环。
• 副产物—— 焦磷酸镁的浊度检测：在核酸大量合成时，从dNTP析出的 焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg离子 结合，产生副产物——焦磷酸 镁，白色沉淀，只要用肉眼观察或浊度仪在400nm光下，检测沉淀浊 度就能够判断扩增与否。
逆转录环介导等温扩增技术
３ 倒 卧保 定
３ １ 侧 卧保 定 。
将 猪 四条 腿 分 别 固 定 起 来 ，猪 就 呈 爬 卧 状 态 ，输 液 、换 药 、打 针 、灌 肠 都 很 方 便。
３． 双 绳 放 倒 法 ５
柄 ，使 之 适 当 勒 紧猪 的 上 颌 ，无 论 多 大 体 重 的 猪 只 也 只有 乖 乖 就 范 ，然 后 另 一
猪 剧 烈 挣 扎 不 安 静 时 ．还 可 再 用 一 条 绳 如法 拴 住 两后 肢 。 ３． 前 后 肢 交 叉 保 定 法 ３ 用 长 ｌ ｍ． 直 径 Ｏ３～ ． ｍ 的 细 － ０５ ｃ
末 端 用 一 根 ４ ｍ 长 的麻 绳 在 近 木 棒 末 ０ｃ 端 １ ｍ 处 ．做 成 一 个 固 定 大 小 的 套 ． ５ｃ 将 套 套 在 猪 上 颌 骨 犬 齿 的后 方 ，随后 收 紧套 绳 ， 即可 将 猪 保 定 。还 可用 一段 长 度 ５ ｍ 左 右 结 实 的 木 棒 、一 段 自行 车 ０ｃ 废 弃 的金 属 闸 线 、两 颗 白行 车 辐 条 冒做 成 专 门的 保 定 棒 ．使 用 时 只 需 一 只手 用 保 定 棒 前 端 的 金 属 圆 环 套 住 生 猪 的 上 颌 ．然 后顺 着 猪 体 方 向 转 动 保 定 棒 的 木
该 法 主要 适 用 于 性 情 较 温 顺 的 猪 。
从 保 定 、 注 射 、佩 带 耳 标 只 需 一 人 操
作 ，节 省 了人 力 ，提 高 了速 度 。
２ ６ 后 腹 部 系绳 保 定 ． 对 于 个 体 较 大 且 凶 猛 难 以 保 定 的
用 两 条 ３ ｍ 长 的 绳 索 ．一 条 系 于 右 前 肢 掌 部 ，另 一 条 系 于 右后 肢跖 部 ．两 绳 端 越 过 腹 下 到 左 侧 ．分 别 向 相 反 方 向 牵 拉 ．猪 即 失 去 平 衡 而 向 右 侧 倒 卧 ． 随 后 ．两 助 手 按 压 住 猪 的 头 部 和 臀 部 ， 根 据 要 求 将 猪 前 后 肢 捆 缚 固定 。
微生物检验PPT培训课件
检测特定生物有机体之间是否存在 亲缘关系
1.待检菌株的DNA双链 2.用碱或热变性使双链解开（DNA的变性） 3. 将单链DNA在硝酸纤维素膜上的固定 4.加放射性标记的DNA或RNA 5.保温（一般是66℃，24h）进行互补碱基配
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、
拷贝数及表达丰度。
杂交的类型
（1）按杂交对象：
DNA-DNA RNA-DNA
（2）按作用环境：
固相杂交：是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支 持物上，一条反应核酸（标记探针）游离在溶液中。
二、核酸探针的工作原理
两条碱基互补的DNA链在适当条件下按碱 基配对原则形成杂交DNA分子。根据DNA遗 传序列的相对稳定性和互补原则，用已知特异 的碱基序列作成有标记的一小段单链(或核苷 酸序列)与被检测材料进行分子杂交。如果被 检测材料中病原的遗传序列与探针具有互补的 碱基序列，就会形成杂交双链，从而证明它们 之间具有一定程度的同源性。（p108）
感器的探针利用
第二节 PCR技术检测微生物
一、 PCR反应的基本原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)就是模板DNA、引物以及四种脱氧核糖核 苷三磷酸(dNTPs )在DNA聚合酶的催化作用下 所发生的酶促聚合反应，PCR反应是由变性--退 火--延伸三个基本反应步骤构成的。
对（杂交） 6.用缓冲溶液洗脱未杂交的部分 7.测定膜的放射性，计算杂交率
核酸等温扩增ppt课件
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
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RPA的原理
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四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
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结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
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引物、探针设计
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LAMP的操作过程
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检测方法
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LAMP技术在病原体检测中的应 用
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LAMP技术小结
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LAMP技术的优点
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存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
rpa等温扩增原理
rpa等温扩增原理
RPA（循环介导等温扩增）是一种新型的核酸扩增方法，它与PCR（聚合酶链反应）相比，具有快速、灵敏、简便等优点，并且不需要复杂的仪器和高温条件。
RPA原理是利用一种特殊的酶体系，在等温条件下，特异性地扩增目标DNA序列。
该酶体系由一个主要的酶（聚合酶）和多个辅助酶组成，可以在温度为37-42℃的条件下进行。
RPA扩增的原理与PCR类似，都是使用一对引物将目标序列扩增成数以百万计的复制品。
但是，RPA使用的酶体系不同于PCR，主要包括一种重组蛋白（recombinase）、一种酶（聚合酶）和一种单链结合蛋白（single-stranded DNA-binding protein）。
这些酶在等温条件下协同作用，能够快速扩增目标序列。
RPA的等温条件使其具有更快的扩增速度和更广的适用范围，可以扩增更长的DNA序列和RNA序列。
因此，RPA已经广泛应用于医疗诊断、食品安全、环境监测等领域。
未来，随着技术的改进和应用的拓展，RPA有望成为核酸扩增领域的重要手段。
- 1 -。
环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用
环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用环介导等温扩增技术是一种新兴的核酸扩增技术，具有操作简便、快速、高灵敏度、高特异性等优点，被广泛应用于病原微生物检测、基因检测、环境监测等领域。
本文就环介导等温扩增技术的原理、特点及其在病原微生物检测中的应用进行综述。
关键词：环介导等温扩增技术；病原微生物检测；核酸扩增；特异性；灵敏度一、引言病原微生物是引起人类疾病的主要原因之一。
传统的病原微生物检测方法包括细菌培养、免疫学检测、荧光定量PCR等，这些方法虽然具有一定的灵敏度和特异性，但存在操作繁琐、时间长、误差大等缺点。
因此，需要开发一种操作简便、快速、高灵敏度、高特异性的病原微生物检测技术。
环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种新兴的核酸扩增技术，具有上述优点，被广泛应用于病原微生物检测、基因检测、环境监测等领域。
本文就环介导等温扩增技术的原理、特点及其在病原微生物检测中的应用进行综述。
二、环介导等温扩增技术原理环介导等温扩增技术是一种在等温条件下进行的核酸扩增技术，其基本原理是利用Bst DNA聚合酶（Bacillus stearothermophilusDNA polymerase）的特殊性质，在等温条件下在DNA模板上进行连续的DNA合成反应，形成具有特异性的DNA扩增产物。
环介导等温扩增技术的反应体系包括以下三个主要部分：（1）Bst DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶是环介导等温扩增反应的关键酶，它具有在等温条件下高效地进行DNA合成的特殊性质，并且在反应过程中可以分解反应体系中的双链DNA和单链DNA，从而释放出反应所需的DNA单链模板。
（2）四个特异性的引物：环介导等温扩增技术需要使用四个特异性的引物（F3、B3、FIP和BIP），它们可以在等温条件下诱导DNA 链的循环扩增，从而形成高度特异性的DNA扩增产物。
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环介导等温扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，
DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特
性的Bst DNA聚合酶 ②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及 进行温度循环。
RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
各类等温扩增技术的比较
NASBA SPIA HDA
温度 ℃ 引物 42 需要2条
42 37/65 1条 需要2条
环介导等温扩增技术原理
主要内容
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
等温扩增的概念
等温扩增技术(Isothermal
Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。
环介导等温扩增核酸技术
环介导等温扩增(Loop-mediated
isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新 技术。 LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要
求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足 快速简便的需求。
等温扩增的优势应用
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
等温扩增的种类
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术
模板 RNA
RNA DNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶
解旋酶，扩增片段 小 DNA聚合酶
SDA
LAMP RCA Qβ
37/65
63 37-65 37
不需要
4条 需要 不需要
DNA
DNA DNA RNA
环介导等温扩增核酸技术优势
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模 板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的 连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。 操作简单：只需一个水浴锅 快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环 而造成 的时间损失 特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区 域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数 量级的差异。 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在 300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的 扩增。灵敏度高易造构
环介导的等温扩增技术原理
环介导等温扩增过程演示
反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
环介导等温扩增引物设计
LAMP反应引物与对应模板区域
环介导的等温扩增技术原理
内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
环介导的等温扩增技术原理
以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。
环介导等温扩增引物设计
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。 LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则 只有内引物被使用。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成， 并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和 B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区域互补。
环介导的等温扩增技术原理
引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链， 并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开， 外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链， 并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和 BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然 发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成 两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP 的基础结构。