[课件]环介导等温扩增技术原理PPT

模板 RNA
RNA DNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶
解旋酶，扩增片段 小 DNA聚合酶
源自文库
SDA
LAMP RCA Qβ
37/65
63 37-65 37
不需要
4条 需要 不需要
DNA
DNA DNA RNA
环介导等温扩增核酸技术优势






LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模 板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的 连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。 操作简单：只需一个水浴锅 快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环 而造成 的时间损失 特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区 域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数 量级的差异。 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在 300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的 扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。
环介导等温扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，
DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特
性的Bst DNA聚合酶 ②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及 进行温度循环。
环介导等温扩增引物设计



针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。 LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则 只有内引物被使用。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成， 并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和 B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区域互补。
环介导的等温扩增技术原理
引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链， 并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开， 外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链， 并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和 BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然 发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成 两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP 的基础结构。
形 成
LAMP
基 础 结 构
环介导的等温扩增技术原理
环介导等温扩增过程演示
反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP reaetion.Lanes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
各类等温扩增技术的比较
NASBA SPIA HDA
温度 ℃ 引物 42 需要2条
42 37/65 1条 需要2条
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要
求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足 快速简便的需求。
等温扩增的优势应用
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
等温扩增的种类
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术
环介导等温扩增技术原理
主要内容
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
等温扩增的概念
等温扩增技术(Isothermal
Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。
环介导等温扩增核酸技术
环介导等温扩增(Loop-mediated
isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新 技术。 LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
环介导等温扩增引物设计
LAMP反应引物与对应模板区域
环介导的等温扩增技术原理

内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
环介导的等温扩增技术原理
以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。