抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体得提取
一、试剂配置
1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195、2×0、05=9、76g)、山梨糖醇(0、33×18
2、2=60、126g)、NaCl(0、010×58、5=0、585g)、MgCl(0、002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0、002=0、5845g)、KH2PO4(200×0、0005=0、1g);使用时加入ASA-Na(198、1×0、002=0、3962g);
2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238、3×0、05=11、915g得HEPES(238、3×0、05=11、915g);
3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml水;
实际配制:
PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),
悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml);
80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml、(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml)
二、提取步骤
1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)
2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)
3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成;
4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物;
5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7、6,含0、33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。

叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素2mg、ml-1以上,这样有利于保持活性。

6、2000g 1min;
7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做)
8、用Percol试剂进行梯度离心(将3ml含有80%Percol(原液按100%算)铺在10ml离心管下层,再把3ml 40%Percol铺在离心管中层,然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)1500g 2-3min(用水平离心头得离心机,离心机加速要缓慢上升,加速度调到1),下降也要缓慢下降,否则会破碎Percol得浓度梯度层得形成,取
出会瞧到3层绿色带,最上层为破碎得叶绿体,沉在地层得为粗颗粒,40-80%得Percol之间得界面有一层绿色层为完整得叶绿体;
9、小心吸出,转移到悬浮介质中,使叶绿体浓度达到1mg、ml-1;(计算:取叶绿体悬浮液0、1ml,加4、9 ml 80%得丙酮,摇匀后于1000g离心2min,上清液置于1cm得比色杯,在625nm上比色,按照公式计算:OD625nm×50/34、5=叶绿素mg/ml)
10、测定叶绿体得完整性,完整率达到85-95%;
参考:Takeda K, Otaubo T,Konda N、Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves、Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018、
取上述制备得完整叶绿体进行如下测定:
1、用50mM PBS(保护酶或其她测定项目得缓冲液)稀释2-5倍,用于测定SOD、POD、CAT、APX;
2、用冷丙酮稀释2倍,取0、5ML提取液用于测定H2O2;(本试验中用0、2 mol/L HClO4稀释)
3、用5%得TCA稀释2-5倍,取1、5ml用于测定MDA;
4、用乙醇:丙酮:水=4、5:4、5:1稀释,用于测定叶绿素;
抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)活性测定方法
一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)
1、试剂得配制
(1)0、05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7、8):
A母液:0、2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358、14)71.7g;
B母液:0、2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156、01)31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0、05mol/L PBS(pH7、8)得配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228、75ml,B母液(NaH2PO4) 21、25ml,用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术、高等教育出版社,2000:267～268。

(2)14、5mM甲硫氨酸溶液:取2、1637g Met用磷酸缓冲液(pH7、8)定容至1000ml。

(3)30μM EDTA-Na2溶液:取0、001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

(4)60μM核黄素溶液:取0、0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。

(5)2、25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液:取0、1840g NBT用PBS定容至100ml,避光保存。

(上述试剂先配好,放到4度冰箱,用之前临时按下面得方法配,然后放在4度冰箱中,不要在最上层,避免见光,第一组样品加好后拿出来加,加完后放回冰箱,第二组得样品加好后再拿出来加)
酶液制备:取0、2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷得研钵中,加入1、6ml 50mmol/L预冷得磷酸缓冲液(pH7、8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上
清液即为酶液。

2、酶活性测定
(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液0、6ml(加得量与前面得浓度要核对),磷酸缓冲液5、4ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后摇匀;
SOD反应混合液:3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml)
(2)分别取3ml反应混合液与30μl(可视情况调整,最好先做一个浓度梯度,瞧加多少合适,如果量太少,最好稀释后再加,这样精确)酶液于试管中(尽可能加到试管得底部,要靠着试管壁打下去先加酶液,后加反应液,加好后摇一摇,瞧瞧试管上就是不就是有雾气,最好拿纱布把试管下边擦一下,免得雾气挡住光线照过去);
(3)将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min;(照光很重要,试管要选择相同规格得,因为不同得试管透光率就是不一样得,试管架不要选择遮光得,这个最好分组做,同时几组做相互之间会遮光,每一组一个重复,就就是每一组中都要有所有得处理,且都要有一个最大管,处理多得话,把根与叶分开做,最大管放在中间)
同时做两支对照管,其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

(4)以不照光得对照管(只有缓冲液并置于暗处)调零后,避光测OD560(出现颜色即可测定)。

(5)酶活性计算:SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量(测得样品值要在最大管得一半左右才合适,否则要调整酶量)为1个酶活单位(u)。

SOD总活性＝[( A ck-A E )×V]/(1/2A ck×W×Vt)
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g FW);比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;A ck为照光对照管得
吸光度;A E为样品管得吸光度;V为样品液总体积(ml,1、6ml,加入PBS得体积);Vt为测定时得酶液用量
(ml,30ul);W为样品鲜重(g,测定时应换算为叶绿体得质量mg);蛋白质含量单位为mg/g。

二、POD、CAT酶活性得测定
粗酶液制备同SOD。

1、过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法)
(1)试剂配制:
0、2mol/L磷酸缓冲液(pH6、0):分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml与B母液(NaH2PO4 ) 877ml混匀即为1000ml PBS(0.2M,pH6、0);
(2)反应混合液配制(以60个样为准):
取200ml PBS(0、2M,pH6、0),加入0、076ml液体(原液)愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷却后加入0、112ml 30％得H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。

POD反应混合液:3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml, 0、076ml, 0、112ml)
(3)样品测定:
取3ml反应液并加入30μl酶液,以PBS为对照调零,而后测定OD470值(测定40秒)。

(边加样边测定,测定前等待5秒,动作要快,如果慢得话,要保证每个样品从加好样到开始记时得时间相差不大)
(4)酶活性计算:以每min OD值变化(升高)0、01为1个酶活性单位(u)。

POD=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0、01×t) (u/g min)
ΔA470:为反应时间内吸光度得变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml,(1、6ml);Vs为测定时取用酶液体积(ml,30ul)。

2、过氧化氢酶(CAT)活性测定
(1)试剂配制:
0、15mol/L磷酸缓冲液(pH7、0):取A母液(Na2HPO4) 457、5 ml 与B母液(NaH2PO4) 292、5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。

(2)反应液配制:取200ml PBS(0、15M,pH7、0),加入0、3092ml 30%得H2O2(原液)摇匀即可。

CA T反应液:3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200 ml, 0、3092ml)
(3)样品测定:取3ml反应液加入0、1ml(可视情况调整)酶液,以PBS为对照调零,测定OD240(紫外)(测定40s)。

(4)酶活性计算:以每min OD值减少0、01为1个酶活性单位(u)。

C A T=[ΔA240×Vt ]/(W×Vs×0、01×t) (u/g min)
ΔA240:为反应时间内吸光度得变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml,1、6ml);Vs为测定时取用酶液体积(ml, 0、1ml)。

三、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性得测定(缓冲液为K)
1、试剂配制(按50个样计算):
(1)0、05 mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH7、0)得配制:
(A)K2HPO4·3H2O:228、22×0、05×0、61=6.9607g
(B)KH2PO4: 136、09×0、05×0、39=2、6538g,以上两者混合起来用去离子水定容到1L。

(2)0、1 mM EDTA-Na2:取0、01861g EDTA-Na2用PBS溶液定容到500 ml(372、24 g/M×0、1mM×500ml=0、01861 g);
(3)5 mM AsA:取0、044g抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml(现用现配,176、13g/M5mM×50ml=0、044 g);
(4)20mMH2O2:取0、2ml,30%H2O2用去离子水稀释到100ml(30% H2O2为550g×30%/(34、01g/M×0、5L)=9、703M)。

实际配置
0、1 mM EDTA-Na2:3个处理*2个品种*3次重复*1、7ml*3次测定=91、8ml;(实际配置250 ml,0、009305g)
5 mM得AsA: 3个处理*2个品种*3次重复*0、1ml*3次测定=5、4ml;(实际配置50 ml,0、044g)
20mM H2O2: 3个处理*2个品种*3次重复*0、1ml*3次测定=5、4ml;(实际配置50 ml,0、1ml)
2、酶活性得测定(以2 ml体系测定)
(1)取0、10 ml 酶液(可视情况调整),加入1、70 ml 含0、1 mM EDTA-Na2得PBS(0、05 mol/L,pH7、0),再加入0、10 ml 5 mM得AsA,最后加入0、10 ml 20mM H2O2,立即在20℃下测定D290(紫外)值在40s
内(测定时间内变化大可测定得时间短点,否则长点)得变化,计算单位时间内AsA减少量与酶活性(室温下测
定,缓冲液调零)。

计算公式:
△OD/△t×Vr×VT
A×d×Vt×W
△OD为反应时间内吸光度得变化(40秒吸光度－0秒吸光度);△t为反应时间(40秒);Vr为反应液体积(2mL);VT提取液体积(1、6mL);A为消光系数(2、8mM-1、cm-1);d为比色杯厚度(1cm);Vt测定液体积(0、1mL);W为样品鲜重(0、2g)。

四、超氧阴离子自由基(O2、-)产生速率得测定(羟胺氧化法)
1、试剂得配制
(1)1mM盐酸羟胺溶液:称取0、02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml;
(2)17mM对氨基苯磺酸溶液:称取1、1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液(冰醋酸:水=1:3配制)加热溶解后定容至400ml;
(3)7mMα-萘胺溶液:称取0、4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液(冰醋酸:水=3:1配制)定容至400ml。

实际配置
PBS(0、05M,pH7、8): 3个处理*2个品种*3次重复*0、5ml*3次测定=27ml;(实际配置100 ml)
1mM盐酸羟胺溶液: 3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;(实际配置100 ml,0、00695g) 17mM对氨基苯磺酸: 3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;(实际配置100 ml,0、
2944g)7mMα-萘胺溶液:3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;(实际配置100 ml,0、1004g)
2、O2、-含量得测定
(1)样品液提取方法同SOD测定;
(2)取0、5ml提取液(酶液)(可视情况调整用量)中加入0、5ml PBS(0、05M,pH7、8),1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。

(3)在25℃下保温1小时;
(4)依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸,再加入1ml 7mM α-萘胺,混合后快速摇匀;
(5)在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后马上进行测定(或置于冰箱待测);
(6)以对照管调零(用水调零),取粉红色水相液测定OD530值(测定);
(7)O2、-含量得计算:由测得得OD530,查NO2-标准曲线得到[NO2-];根据羟胺与O2、-得反应式:NH2OH＋2O2、-＋H+NO2-＋H2O2＋H2O 计算[O2、-],即[NO2-]×2=[O2、-];再根据样品与羟胺反应得时间与样品中得蛋白质含量,求得O2、-产生速率(以nmol min-1mg-1蛋白表示,也可以nmol min-1g-1鲜重表示)。

O2、-产生速率=(C×V)/(t×W) (nmol min-1g-1鲜重)
C为标准曲线上查得得浓度(umol/L);V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后得体积);t为反应时间(60min);W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)
参考文献:王爱国,罗广华.植物生理学通讯,1990,(6):55～57
五、可溶性蛋白含量得测定(考马斯亮蓝染色法)
1、试剂得配制
(1)考马斯亮蓝溶液配制:称取100 mg考马斯亮蓝,溶于50 ml 90％乙醇中,加入100 ml 85％(W/V)得磷酸,再用蒸馏水定容到1Ｌ。

在过夜后过滤并贮于棕色瓶中,常温下可在暗中保存一个月。

(2)100μg/ml牛血清蛋白(BSA)标准溶液:称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml,再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml(也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml标准BSA溶液)。

实际配置
0、05M,pH7、8磷酸缓冲液:3个处理*2个品种*3次重复*0、08ml*3次测定=0、3456ml;(实际配置100
ml,)
考马斯亮蓝溶液: 3个处理*2个品种*3次重复*2、9ml*3次测定=156、6ml; (实际配置200 ml,20mg) 2、样品可溶性蛋白含量得测定
(1)样品可溶性蛋白含量测定:取20μl提取液(酶液)加入80μl,0、05M,pH7、8磷酸缓冲液(即稀释成0、1ml提取液),再加入2、9ml考马斯亮蓝溶液,反应2min后测OD595(以100μl缓冲液加2、9ml考马斯亮蓝为对照调零)。

(2)蛋白质含量计算:
可溶性蛋白质含量(mg/g)=(C×V T)/(W×V S×1000)
C为标准曲线查得得蛋白质含量(μg);V T为提取液总体积(稀释后得体积ml);V S为测定时所用提取液体积(ml,20μl);W为样品鲜重(g)。

过氧化氢(H2O2)含量得测定
一、试剂配制:
1、0、2 mol/L HClO4:取10、05g HClO4溶解于0、5L得水中;
2、4 mol/L KOH:取112 g KOH溶解于0、5L得水中;
3、0、1 mol/L,pH 6、5得磷酸缓冲液:Na2HPO4·12H2O5、6407g+NaH2PO4·2H2O5、3433g用去离子水定容到500ml;
4、显色液:100mL、0、1 mol/L、pH 6、5得磷酸缓冲液+25 μL N,N-二甲基苯胺+10 mg 4-氨基氨替吡啉;
5、过氧化物酶溶液(250 U/mL)
二、测定步骤:
称取植株根与叶片组织各0.5g,分别置于研钵中,加入1、6 mL预冷至4℃得0、2 mol/L HClO4,冰浴匀浆,于10 000×g离心5 min(4℃),取上清液,加4 mol/L KOH调pH值为7、5后,再于10 000×g离心5 min(4℃),取上清液1 mL,加0、4 mL显色液与0、1mL过氧化物酶溶液(250 U/mL),用岛津UV-1601分光光度计测定波长550 nm(可见)处光密度值得变化,H2O2含量以μmol/gFW表示。

(用什么调零？)
三、计算方法:(要做标线？)
参考:过氧化氢(H2O2)含量得测定参照Uchida等(2002)方法并加以改进。

还原型谷胱苷肽GSH
2．试剂配制
(1)1mM GSH标准液10mL(现用现配):称3、0733mgGSH,加蒸馏水至10mL。

(不要)
(2)5％磺基水杨酸500mL:25g溶于500mL水中。

(3)6mM DTNB:称取0.118905g DTNB溶于50mL PBS(0.1M,pH7、5)中。

(4)2mM NADPH:18、1mg NADPH溶于10mL PBS中。

(5)1mMGSSG标准液10mL:6、126mg GSSG加PBS至10mL。

(不要)
实际配置
0、1M PBS(pH 7、5): 3个处理*2个品种*3次重复*0、5ml*3次测定=27ml; (实际配置50 ml)
6mM DTNB: 3个处理*2个品种*3次重复*0、2ml*3次测定=10、8ml; (实际配置50 ml,实际用量0、1189g)
2mM NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0、1ml*3次测定=5、4ml;(实际配置50 ml, 实际用量18、1mg)
(1U)GRⅢ: 3个处理*2个品种*3次重复*0、1ml*3次测定=5、4ml; (实际配置50 ml, 实际用量10ml)
5％磺基水杨酸:3个处理*2个品种*3次重复*0、01ml*3次测定=0、54ml;(实际配置10ml)(实际用量0、5g/10ml)
0.5mM PBS: 3个处理*2个品种*3次重复*1、5ml*3次测定=81ml; (实际配置100 ml)
乙醚(二乙醚): 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; (实际配置1000 ml)
PBS Buffer 0、5mM: 3个处理*2个品种*3次重复*1、5ml*3次测定=81ml; (实际配置150 ml)
2-乙烯吡啶: 3个处理*2个品种*3次重复*0、2ml*3次测定=10、8ml; (实际用量20 ml)
乙醚: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; (实际用量1000 ml)
1.标线制作:
配制浓度为0,0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM得标准GSH溶液(吸取上述标准液各0、1mL)加入0、5mL 0.1M磷酸钠Buffer(pH7、5)(含5mM EDTA),0、2mL 6mM DTNB,0、1mL 2mM NADPH,0、
1mL(1U)GRⅢ(谷胱甘肽还原酶)(sigma),从0、1mL GSH启动反应,测定650s得A412(OD412),绘制标准曲线。

以PBS代替DTNB作空白。

3．GSH(还原型谷胱甘肽)及GSSH(氧化型谷胱甘肽)
(1)取1g新鲜叶片,加入10µL(可以取0.2g鲜样,加1、6ml提取液)5％磺基水杨酸,研磨后在14000g离心10分钟,取1mL上清液,加入1、5mL,0.5mM PBS (pH7、5)中,再用5mL乙醚(二乙醚)抽取二次(杂质会融到乙醚层中,而乙醚处于整个反应体系得上层,您直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可,反复进行两次即为抽取两次),此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。

各取1mL上清液,加入1、5mL PBS Buffer 0.5mM (pH7、5),0、2mL 2-乙烯吡啶(原装试剂浓度)混合至乳胶状,在25℃反应1小时,再用5mL乙醚(原装试剂浓度)抽提2次,此提取液用于分析GSSG『GSSG－氧化型谷胱甘肽, GSH－还原型谷胱甘肽不能够直接测出,需测出氧化型与还原型谷胱甘肽含量,即总得谷胱甘肽含量,然后减去氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量得到还原型谷胱甘肽含量(GSH))
(2)取反应混合液(0、5mL 0.1M PBS(pH 7、5)(内含5mM EDTA),0、2mL 6mM DTNB,0、1mL 2mM
NADPH,0、1mL(1U)GRⅢ(sigma),由加入0、1ml提取液开始反应,测OD412,在25℃下,反应650s(大约十分钟),分别计算总谷胱苷肽及GSH含量。

以不加DTNB,加相应剂量得PBS作空白。

GR(谷胱苷肽还原酶)测定
一、试剂配置
50mM PBS(K)(pH 7、0,含0、2mmol EDTA,与APX得相同):K2HPO4·3H2O 6、9607g+KH2PO4 2、6538g混
合后定容到1L;然后加入292、25×0、2=58、45gEDTA;
10mM GSSG(用水配):612、63×10×0、001=6、126g溶于1L水中;
2、4mM NADPH(用PBS配):83
3、4×2、4×0、001=2、0g溶于1L水中、
实际配置
50mM PBS(K): 3个处理*2个品种*3次重复*1、7ml*3次测定=91、8ml; (实际配置150 ml,实际用量58、45g*0、15=8、7675g)
10mM GSSG: 3个处理*2个品种*3次重复*0、1ml*3次测定=5、4ml; (实际配置50 ml,实际用量6、126g*0、05=0、3063g)
2、4mM NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0、1ml*3次测定=5、4ml; (实际配置50 ml,实际用量2、0g*0、05=0、1g)
二、测定步骤
用3mL比色杯,依次加入1700µL 50mM PBS(K)(pH 7、8,含0、2mmol EDTA),100µL 10mmol GSSG,100µL 2、4mmol NADPH,100µL 酶液(叶绿体悬浮液,与APX相同)启动反应,25℃,以NADPH启动发应(指最后加NADPH),测定OD340,1min变化值,吸光系数2.8mM-1cm-1,不加NADPH为对照(调零)。

四、计算方法:
△OD/△t×Vr×VT
A×d×Vt×W
△OD为反应时间内吸光度得变化(60秒吸光度－0秒吸光度);△t为反应时间(60秒);Vr为反应液体积(2mL);VT提取液体积(叶绿体稀释后得体积);A为消光系数(2、8mM-1、cm-1);d为比色杯厚度(1cm);Vt测定液体积(0、1mL);W为样品鲜重(叶绿体质量)。