第三章酶蛋白的化学修饰
生物化学试题 酶
第三章酶.三、典型试题分析1．一个酶作用于多种底物时，其天然底物的Km值应该是(1995年生化考题)A．最大B．与其他底物相同C．最小D．居中E．与K3相同[答案] C2. 下列关于酶的活性中心的叙述哪些是正确的（1996年生化考题）A.所有的酶都有活性中心B. 所有的酶活性中心都含有辅酶C. 酶的必需基团都位于活性中心之内D. 所有抑制剂都作用于酶的活性中心E. 所有酶的活性中心都含有金属离子[答案] A3. 乳酸脱氢酶经透析后，催化能力显着降低，其原因是（1997年生化考题）A. 酶蛋白变形B. 失去辅酶C. 酶含量减少D. 环境PH值发生了改变E. 以上都不是[答案] B4. 关于酶的化学修饰，错误的是A. 酶以有活性（高活性），无活性（低活性）两种形式存在B. 变构调节是快速调节，化学修饰不是快速调节B.两种形式的转变有酶催化D. 两种形式的转变由共价变化E. 有放大效应[答案] B5. ．测定酶活性时，在反应体系中，哪项叙述是正确的A．作用物的浓度越高越好B．温育的时间越长越好C．pH必须中性D．反应温度宜以3713为佳E．有的酶需要加入激活剂[答案] E6．下列关于酶活性中心的叙述哪些是正确的(1999年生化试题)A．是由一条多肽链中若干相邻的氨基酸残基以线状排列而成B．对于整个酶分子来说，只是酶的一小部分C. 仅通过共价键与作用物结合D．多具三维结构(答案] B和D7．酶的变构调节A．无共价键变化B．构象变化C．作用物或代谢产物常是变构剂D．酶动力学遵守米式方程(答案) A、B和C8. 酶原之所以没有活性是因为(2000年生化试题)A. 酶蛋白肽链合成不完全B．缺乏辅酶或辅基C. 活性中心未形成或未暴露D. 酶原是已经变性的蛋白质E. 酶原是普通的蛋白质[答案] C四、测试题(一)A型题1，下列对酶的叙述，哪一项是正确的?A．所有的蛋白质都是酶B，所有的酶均以有机化合物作为底物C. 所有的酶均需特异的辅助因子D．所有的酶对其底物都是有绝对特异性E．少数RNA具有酶一样的催化活性2．在常温常压及中性pH条件下，酶比一般催化剂的效率可高A．10～102倍B．102～104倍巳104～108倍D．108～1012倍E．1020倍以上3．以下哪项不是酶的特点A．多数酶是细胞制造的蛋白质B．易受pH，温度等外界因素的影响C．只能加速反应，不改变反应平衡点D．催化效率极高E．有高度特异性4．下列哪种酶为结合酶A．淀粉酶B．酯酶 C. 转氨酶D，核糖核酸酶E．脲酶5．结合酶在下列哪种情况下才有活性A．酶蛋白单独存在B．辅酶单独存在C，亚基单独存在D．全酶形式存在E，有激动剂存在6．下列哪种辅酶中不含核苷酸A．FAD B．FMN C，FH4 D．NADP+ E，CoASH7. 下列哪中种辅酶中不含维生素A. CoASH B．FAD C．NAD+ D．CoQ E. FMN8. 对340nm紫外光有吸收特性的辅酶是A. FADH2 B．NAD+ C．FMN D．TPP E. NADH9. 辅酶的作用机理主要在于A. 维持酶蛋白的空间构象B。
第三章 酶的化学修饰
第三章酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
第三章 酶 一、 名词解释 1 Km 2 限速酶 3 酶的化学修饰 4 结合酶 5
第三章酶一、名词解释1.Km2.限速酶3.酶的化学修饰4.结合酶5.Allosteric regulation6.别构调节7.Activators8.辅基9.反竞争性抑制作用10.酶的特异性二、填空1.在酶浓度不变的情况下，底物浓度对酶促反应速度的作图呈____________双曲线，双倒数作图呈线。
2. Km值等于酶促反应速度为最大速度时的________________浓度。
3.关键酶所催化的反应具有下述特点：催化反应的速度，因此又称限速酶；催化反应，因此它的活性决定于整个代谢途径的方向；这类酶常受多种效应剂的调节。
4. 可逆性抑制作用中，抑制剂与酶的活性中心相结合，抑制剂与酶的活性中心外的必需基团相结合。
5. 酶的化学修饰主要有磷酸化与脱磷酸，，________________，腺苷化与脱腺苷及SH与-S-S-互变等，其中磷酸化与脱磷酸化在代谢调节中最为多见。
6. 同工酶指催化的化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质的一组酶。
7. 竞争性抑制剂使酶对底物的表观Km ，而Vmax 。
8. 酶的特异性包括特异性，特异性与特异性。
三、问答1.简述酶的“诱导契合假说”。
2.酶与一般催化剂相比有何异同？3.什么是同工酶？请举例说明。
4.金属离子作为酶的辅助因子有哪些作用？5.说明温度对酶促反应速度的影响及其实用价值。
参考答案一、名词解释1. 即米氏常数。
Km米氏常数是单底物反应中酶与底物可逆地生成中间产物和中间产物转化为产物这三个反应的速度常数的综合。
Km=k2+k3/k1 米氏常数等于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
2.指整条代谢通路中，催化反应速度最慢的酶，它不但可以影响整条代谢途径的总速度，还可改变代谢方向，是代谢途径的关键酶，常受到变构调节和/或化学修饰调节。
3.某些酶分子上的一些基团，受其他酶的催化发生共价化学变化，从而导致酶活性的变化。
4.酶分子中除含有氨基酸残基组成的多肽链外，还含有非蛋白部分。
酶分子的化学修饰
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
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根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
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二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
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侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
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（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
酶分子的化学修饰
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
第三章酶蛋白的化学修饰
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பைடு நூலகம் 四、胍基修饰
采用二羰基化合物与精氨酸残基侧链上的 胍基反应生成稳定的杂环，从而改变酶分 子的空间构象的修饰方法。
用作胍基修饰剂的二羰基化合物主要有：
丁二酮 1，2-环己二酮 丙二酮 苯乙二醛 4－羟基－3－硝基苯乙二醛 对硝基苯乙二醛
二、定点突变技术
定点突变（site directed mutagenesis）是指在DNA序列 中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的 操作技术。
20世纪80年代发展起来，常用于蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰。
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定点突变技术用于酶分子修饰的过程
酶蛋白的基本组成单位是氨基酸，将酶分子肽链上 的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称 为氨基酸置换修饰。
酶RNA的基本组成单位是核苷酸，将酶分子核苷酸 链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法， 称为核苷酸置换修饰 。
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一、组成单位置换修饰的作用
提高酶活力 增强酶的稳定性 使酶的专一性发生改变
酶的侧链基团修饰方法很多，主要有：氨基修饰、 羧基修饰、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑 基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰、大分子结 合修饰等。
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一、氨基修饰
采用某些化合物使酶分子侧链上的的氨基发生改变、从 而改变酶蛋白的空间构象的方法
凡能够作用于酶分子侧链上的氨基，产生脱氨基作用或 与氨基共价结合将氨基屏蔽起来的化合物，称为氨基修 饰剂。
2-羟基-5-硝基苄溴（HNBB）和4-硝基苯硫氯可以 比较专一地对吲哚基进行修饰，但也可以与巯基反 应，因此用于吲哚基修饰时，要对巯基进行保护。
(完整)生物化学名词解释
生物化学名词解释第一章蛋白质的结构与功能1。
肽键：一分子氨基酸的氨基和另一分子氨基酸的羧基通过脱去水分子后所形成的酰胺键称为肽键。
2. 等电点：在某一pH溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子,成点中性，此时溶液的pH称为该氨基酸或蛋白质的等电点。
3. 模体：在蛋白质分子中，由两个或两个以上具有二级结构的肽段在空间上相互接近,形成一个特殊的空间构象,并发挥特殊的功能，称为模体。
4. 结构域:分子量较大的蛋白质三级结构常可分割成多个结构紧密的区域，并行使特定的功能，这些区域被称为结构域.5。
亚基:在蛋白质四级结构中每条肽链所形成的完整三级结构。
6. 肽单元:在多肽分子中，参与肽键的4个原子及其两侧的碳原子位于同一个平面内，称为肽单元。
7. 蛋白质变性:在某些理化因素影响下,蛋白质的空间构象破坏，从而改变蛋白质的理化性质和生物学活性，称之为蛋白质变性。
第二章核酸的结构与功能1。
DNA变性：在某些理化因素作用下，DNA分子稳定的双螺旋空间构象破环,双链解链变成两条单链，但其一级结构仍完整的现象称DNA变性.2。
Tm：即溶解温度，或解链温度,是指核酸在加热变性时，紫外吸收值达到最大值50%时的温度.在Tm时,核酸分子50％的双螺旋结构被破坏。
3. 增色效应：核酸加热变性时，由于大量碱基暴露,使260nm处紫外吸收增加的现象，称之为增色效应.4. HnRNA：核内不均一RNA。
在细胞核内合成的mRNA初级产物比成熟的mRNA分子大得多，称为核内不均一RNA。
hnRNA在细胞核内存在时间极短,经过剪切成为成熟的mRNA，并依靠特殊的机制转移到细胞质中.5。
核酶：也称为催化性RNA，一些RNA具有催化能力，可以催化自我拼接等反应，这种具有催化作用的RNA分子叫做核酶。
6. 核酸分子杂交：不同来源但具有互补序列的核酸分子按碱基互补配对原则，在适宜条件下形成杂化双链，这种现象称核酸分子杂交.第三章酶1. 酶：由活细胞产生的具有催化功能的一类特殊的蛋白质。
第三章 酶蛋白的化学修饰
典型实例：TPCK专一作用胰凝乳蛋白酶
对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯
对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮
胰凝乳蛋白酶合成底物
TPCK
TLCK专一作用胰蛋白酶
对甲苯磺酰-L-赖氨酸甲酯 对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲基酮
胰蛋白酶合成底物
TLCK
亲和标记的动力学特征
亲和标记作用过程： 一般化学修饰反应速度和修饰剂浓度成正比。但 亲和标记反应速度：V = k [EI], 不和修饰剂浓度成 正比，而是表现为饱和动力学特征，最大反应速 度为全部酶成为复合物时的速度，即Vm= k [E0]。 按和推导米氏公式类似方法可得到： 式中Vm和V分别为[I]饱和和不饱和 时的失活速度。Ks为可逆结合步骤 的解离常数。
亲和标记反应动力学公式
由于 Vm = k[E0]， V = kobs[E0] ， 由上式可得到 :
式中k为修饰步骤的真实速度常数，kobs 为测定的速度常数。此速度常数为一级速 度常数。 此式双倒数作图为直线。由直线斜率和Y 轴截距可计算k和Ks。
实验判断
动力学方法是最广泛易行的亲和标记实 验判断方法。 实验设计： 选择若干修饰剂浓度，在可测定的条件 下浓度差距越大越好。对每个浓度作失 活过程实验，半对数作图得到速度常数 测定值。以kobs对修饰剂浓度作图，为正 比直线的是简单二级反应，为双曲线 （双倒数作图为直线）的是亲和标记。
亲和标记的判断实例
（From Tian WX., Wang YS. And Hsu R.(1989) Biochim.Biophy. Acta 998, 310）
第四节 亲和标记及其判定
亲和标记记是最有意义的一种化学修饰，这是 因为它可以很专一性地作用于酶的活性部位。 亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆地结合 在酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位特 定基团，一般是必需基团，而造成不可逆失 活。亲和标记修饰剂一般是底物类似物，和 底物含有共同的结合于酶的基团。
第3章1由活细胞合成的、对其特异底物具有高效催化作用的特殊蛋白质。习题资料
第三章酶复习测试二）选择题A型题：1．关于酶的叙述正确的是： A．所有酶都有辅酶 B C．绝大多数酶的化学本质是蛋白质 E．酶不能在胞外发挥催化作用．酶的催化作用与其空间结构无关D ．酶能改变化学反应的平衡点2．对于酶的叙述下列哪项是正确的：A．酶对底物都有绝对特异性B．有些 RNA具有酶一样的催化作用C．酶的催化活性都与空间结构的完整性有关D．所有酶均需特异的辅助因子E．酶只能在中性环境发挥催化作用3．关于酶催化作用的叙述不正确的是：A．催化反应具有高度特异性 B C．催化活性可以调节 DE．催化作用可以改变反应的平衡常数4．下列哪种酶属于结合酶：A．脲酶 BC．胃蛋白酶 DE．己糖激酶．催化反应所需要的条件温和．催化效率极高．核糖核酸酶．脂肪酶5．结合酶在下列哪种情况下才具有催化活性：A．酶蛋白形式存在 B ．辅酶形式存在C．辅基形式存在 D ．全酶形式存在E．酶原形式存在6．关于酶蛋白和辅助因子的叙述错误的是：A．二者单独存在时酶无催化活性 B C ．全酶才有催化作用 DE ．一种辅助因子只能与一种酶蛋白结合．二者形成的复合物称全酶．辅助因子可以是有机化合物7．辅酶与辅基的主要区别是：A ．化学本质不同BC ．与酶蛋白结合的紧密程度不同 E ．生物学活性不同8．全酶中决定酶催化反应特异性的是 A ．全酶 B C ．酶蛋白 DE．以上都不是9．关于辅助因子的叙述错误的是：A ．参与酶活性中心的构成 C ．包括辅酶和辅基 D E．维生素可参与辅助因子构成10．酶与一般催化剂的共同点是：A．高度特异性 BC ．降低反应的活化能DE ．催化活性可以调节．免疫学性质不同D ．理化性质不同．辅基．辅酶B ．决定酶催化反应的特异性．决定反应的种类、性质．高度催化效率．改变化学反应的平衡点11．对酶活性中心的叙述错误的是：A ．结合基团在活性中心内BC ．具有特定的空间构象DE ．底物在此被转变为产物12．酶催化作用的机制是：A ．降低反应的活化能BC ．降低产物的热能 DE．增加反应的自由能13．酶催化效率高的原因是： A．降低反应的自由能 BC．降低产物能量水平 DE．升高产物能量水平．催化基团属于必需基团．空间结构与酶催化活性无关．降低反应的自由能．增加底物的热能．降低反应的活化能．升高活化能14．酶的特异性是指：A．与底物结合具有严格选择性 C ．催化反应的机制各不相同E ．在特定条件下起催化作用B ．与辅酶的结合具有选择性D ．在细胞中有特殊的定位L-型乳酸脱氢，属于：B ．相对特异性D ．立体异构特异性 16．加热后，酶活性降低或消失的主要原因是：A ．酶水解B ．酶蛋白变性C ．亚基解聚D ．辅酶脱落E ．辅基脱落 17．含有唾液淀粉酶的唾液透析后，水解能力下降，其原因是： A ．酶蛋白变性 B ．失去 Cl -C ．失去 Hg 2+D ．失去酶蛋白E ．酶含量减少19．酶保持催化活性，必须具备： A ．酶分子结构完整无缺 B C ．有金属离子参加 D E ．有辅酶参加20．酶催化作用所必需的基团主要是指： A ．维持酶一级结构所必需的基团B ．位于活性中心，维持酶活性所必需的基团C ．与酶的亚基结合所必需的基团D ．维持酶空间结构所必需的基团E ．构成全酶分子所有的基团21．酶分子中使底物转变为产物的基团称为： A ．结合基团 B ．催化基团 C ．碱性基团 D ．酸性基团 E ．疏水基团22．关于酶活性中心的叙述正确的是： A ．酶可以没有活性中心 B C ．都含有金属离子 D E ．以上都不是 15．乳酸脱氢酶只能催化 A ．绝对特异性C ．化学键特异性 E ．化学基团特异性18．全酶是指：A ．酶蛋白 - 辅助因子复合物C ．酶活性中心 - 底物复合物 E ．酶催化基团 - 结合基团复合物 B ．酶蛋白 - 底物复合物 D．酶必需基团 - 底物复合物．酶分子上所有化学基团存在 ．都以-SH 或-0H 作为结合基团23酶促反应速度达到最大速度的80％时， Km等A ． [S] B ．1/2 [S] C ．1/3 [S] D ．1/4 [S] E ．1/5 [S]24酶促反应速度达最大速度的25％时， [S] 等于：A ．1/4 Km B ．3/4 Km C ．2/3 Km D ．1/2 Km E ．1/3 Km25．当 Km等于 1/2 [S] 时，A ． 1/3 Vmax C ． 2/3 VmaxE． 3/4 Vmax v 等于：B ． 1/2 Vmax D ． 3/5 Vmax26．同工酶是指：A．酶蛋白分子结构相同 B C．催化功能相同 D E．理化性质相同．免疫学性质相同27．Km值是指：A ． v 等于 1/2 Vmax 时的底物浓度BC ． v 等于 1/2 Vmax时的温度DE ．降低反应速度一半时的底物浓度v 等于 1/2 Vmax 时的酶浓度v 等于 1/2 Vmax时的抑制剂浓28．酶的 Km值大小与：A．酶性质有关 BC．酶作用温度有关 D E ．环境 pH 有关．酶浓度有关．酶作用时间有关A ．结合基团B ．催化基团C ．疏水基团D ．亲水基团E ．以上都不是30．酶促反应速度与底物浓度的关系可用：A ．诱导契合学说解释BC ．多元催化学说解释D ．中间产物学说解释31．酶促反应动力学研究的是： A．酶促反应速度与底物结构的关系 B．酶促反应速度与酶空间结构的关系29．酶的活性中心内，能够与底物结合的基团C．酶促反应速度与辅助因子的关系D．酶促反应速度与影响因素之间的关系E ．不同酶分子间的协调关系32．酶促反应速度与酶浓度成正比的条件是：A ．底物被酶饱和B ．反应速度达最大C ．酶浓度远远大于底物浓度D ．底物浓度远远大于酶浓度E ．以上都不是33．v＝Vmax后再增加 [S] ， v 不再增加的原因是：A ．部分酶活性中心被产物占据B．过量底物抑制酶的催化活性C．酶的活性中心已被底物所饱和D．产物生成过多改变反应的平衡常数E ．以上都不是34．底物浓度达到饱和后，再增加底物浓度：A ．反应速度随底物浓度增加而加快B ．随着底物浓度的增加酶活性降低C．酶的结合部位全部被底物占据，反应速度不再增加D．增加抑制剂，反应速度反而加快E．形成酶 - 底物复合体增加35．关于温度与酶促反应速度关系的叙述错误的是：A ．酶在短时间可耐受较高温度B ．酶都有最适温度C ．超过最适温度酶促反应速度降低D ．最适温度时反应速度最快E ．以上都不是36．温度与酶促反应速度的关系曲线是：A ．直线B ．矩形双曲线C ．抛物线D ．钟罩形曲线E ．S 形曲线37．关于 pH 与酶促反应速度关系的叙述正确的是： A ． pH 与酶蛋白和底物的解离无关 B ．反应速度与环境 pH 成正比C．人体内酶的最适 pH均为中性即 pH＝7 左右 D．pH对酶促反应速度影响不大E．以上都不是38．关于抑制剂对酶蛋白影响的叙述正确的是：A ．使酶变性而使酶失活B ．使辅基变性而使酶失活C ．都与酶的活性中心结合D ．除去抑制剂后，酶活性可恢复E ．以上都不是39．化学毒气路易士气可抑制下列那种酶：A ．胆碱酯酶B ．羟基酶C ．巯基酶D ．磷酸酶E ．羧基酶40．有机磷农药（敌百虫）中毒属于：A ．不可逆抑制B ．竞争性抑制C ．可逆性抑制D ．非竞争性抑制E ．反竞争性抑制41．可解除 Ag2+、 Hg2+等重金属离子对酶抑制作用的物质是：A ．解磷定B ．二巯基丙醇C ．磺胺类药D ． 5FUE ． MTX42．有机磷农药敌敌畏可结合胆碱酯酶活性中心的：A ．丝氨酸残基的 -0HB ．半胱氨酸残基的 -SHC ．色氨酸残基的吲哚基D ．精氨酸残基的胍基E ．甲硫氨酸残基的甲硫基43．可解除敌敌畏对酶抑制作用的物质是：A ．解磷定B ．二巯基丙醇C ．磺胺类药物D ． 5FUE ． MTX44．有机磷农药中毒主要是抑制了：A ．二氢叶酸合成酶BC ．胆碱酯酶DE ．碳酸酐酶．二氢叶酸还原酶．巯基酶45．丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用属于：A ．不可逆性抑制C ．非竞争性抑制E ．非特异性抑制B ．竞争性抑制D ．反竞争性抑制46．磺胺类药物的类似物是：A ．叶酸BC ．谷氨酸DE ．二氢叶酸．对氨基苯甲酸．甲氨蝶呤47．磺胺类药物抑菌或杀菌作用的机制是：A ．抑制叶酸合成酶 BC ．抑制二氢叶酸合成酶 DE ．抑制四氢叶酸合成酶48．能够使胰蛋白酶原激活的物质是：A ．肠激酶B ．胰凝乳蛋白酶C ．弹性蛋白酶D ．羧肽酶E ．胆汁酸 49．以下有关酶与一般催化剂共性的叙述不正确的是： A ．都能加快化学反应速度B ．其本身在反应前后没有结构和性质上的改变C ．只能催化热力学上允许进行的化学反应D ．能缩短反应达到平衡所需要的时间E ．能改变化学反应的平衡点50．胰蛋白酶原的激活是由其 N-端水解掉： A ．3 肽片段 B ．4肽片段 C ．5 肽片段 D ．6肽片段E ．7 肽片段 51．关于同工酶的描述错误的是： A ．酶蛋白的结构不同 B C ．生物学性质相同 D E ．以上都不是 52国际酶学委员会将酶分6 类的依据是：A ．根据酶蛋白的结构 B．根据酶的物理性质 C ．根据酶促反应的性质 D ．根据酶的来源E ．根据酶所催化的底物53．关于酶与临床医学关系的叙述错误的是：A ．乙醇可诱导碱性磷酸酶合成增加B ．体液酶活性改变可用于疾病诊断C ．细胞损伤时，细胞酶释入血中的量增加D ．酶可用于治疗疾病E ．酪氨酸酶缺乏可引起白化病54．关于酶促反应特点的描述错误的是：A ．酶能加速化学反应速度B ．酶在体内催化的反应都是不可逆反应C ．酶在反应前后无质和量的变化D ．酶对所催化的反应具有高度选择性E ．酶能缩短化学反应到达平衡的时间．抑制二氢叶酸还原酶．酶分子活性中心结构相同55．酶促反应作用的特点是：A ．保证生成的产物比底物更稳定B ．使底物获得更多的自由能 C．加快反应平衡到达的速率 D ．保证底物全部转变成产物E ．改变反应的平衡常数56．在其他因素不变的情况下改变底物浓度时：A ．酶促反应初速度成比例改变B ．酶促反应初速度成比例下降C ．酶促反应速度成比例下降D ．酶促反应速度变慢E ．酶促反应速度不变57．酶浓度不变以反应速度对底物作图其图像为：A ．直线B ．S 形曲线C ．矩形双曲线D ．抛物线E ．钟罩形曲线58．含 LDH5 丰富的组织是：A ．肝B ．心肌 C．红细胞 D ．肾E．脑59．乳酸脱氢酶同工酶是由H亚基、 M亚基组成的：A．二聚体C．四聚体E．六聚体．三聚体．五聚体60．酶的国际分类不包括：A ．转移酶类 BC．裂合酶类 D E．以上都不是61．蛋白酶属于：A ．氧化还原酶类B C．裂解酶类 DE．异构酶类．水解酶类．异构酶类．转移酶类．水解酶类A ．酶和底物构象都发生改变B ．酶和底物构象都不发生改C ．主要是酶的构象发生改变D ．主要是底物的构象发生改变E ．主要是辅酶的构象发生改变63 ．不属于金属酶和金属活化酶的是：A．羧基肽酶 B ．己糖激酶 C ．肌酸激酶 D ．丙酮酸羧化酶E．以上都不是62．诱导契合假说认为在形成酶 - 底物复合物65．有关酶的描述哪项是正确的： A ．同工酶是一组功能与结构相同的酶B ．变构酶是指代谢物与酶结合后，酶结构发生改变的酶C ．在酶的活性中心内，只有侧链带电荷的氨基酸直接参与酶的催化反应D ．酶催化反应初速度取决于酶的浓度E ．非竞争性抑制剂只能改变酶促反应 v ，而不改变该酶 Km 值66．胰蛋白酶最初以酶原形式存在的意义是： A ．保证蛋白酶的水解效率 B ．促进蛋白酶的分泌C ．保护胰腺组织免受破坏D ．保证蛋白酶在一定时间内发挥作用E ．以上都不是 67．砷化物对巯基酶的抑制作用属于： A ．反馈抑制 B ．不可逆抑制 C ．竞争性抑制 D ．非竞争性抑制 E ．反竞争性抑制68．非竞争性抑制的特点是：A ．抑制剂与底物结构相似B ．抑制程度取决于抑制剂的浓度C ．抑制剂与酶活性中心结合D ．酶与抑制剂结合不影响其与底物结合E ．增加底物浓度可解除抑制 69．关于竞争性抑制作用特点的叙述错误的是：A ．抑制剂与底物结构相似B ．抑制剂与酶的活性中心结合C ．增加底物浓度可解除抑制D ．抑制程度与 [S] 和 [I] 有关E ．以上都不是 70．对于酶化学修饰的描述错误的是： A ．有磷酸化反应和脱磷酸反应 B ．化学修饰调节需要不同酶参加C ．化学修饰调节属于快速调节D ．化学修饰调节过程需要消耗 ATPE ．以上都不是 71．活化能的概念是指：A ．底物和产物之间能量的差值B ．活化分子所释放的能量C ．分子由一般状态转变成活化状态所需能量D ．温度升高时产生的能量64．酶活性是指：A ．酶催化的反应类型BC ．酶自身变化的能力 DE ．以上都不是．酶催化能力的大小．无活性的酶转变成有活性的酶能E ．以上都不是72．关于酶活性中心的叙述哪项正确： A ．所有酶的活性中心都含有金属离子 B ．所有抑制剂都作用于酶的活性中心C ．所有的必需基团都位于活性中心内D ．所有酶的活性中心都含有辅酶E ．所有的酶都有活性中心 73．酶加速化学反应的根本原因是： A ．升高反应温度 B ．增加反应物相互碰撞的频率 C ．降低催化反应的活化能 D ．增加底物浓度 E ．降低产物的自由能 74．关于酶高效催化作用机制的叙述错误的是： A ．邻近效应与定向排列作用 B ．多元催化作用 C ．酸碱催化作用 D ．表面效应作用 E ．以上都不是75．关于酶促反应特点的论述错误的是： A ．酶在体内催化的反应都是不可逆的 B ．酶在催化反应前后质量不变C ．酶能缩短化学反应到达平衡所需时间D ．酶对所催化反应有选择性E ．酶能催化热力学上允许的化学反应 76．下列哪项不是影响酶促反应速度的因素： A ．底物浓度 B ．酶浓度 C ．反应环境的温度 E ．酶原浓度77．关于 Km 的意义正确的是： A ．Km 表示酶的浓度 B C ．Km 的单位是 mmo1/L D E ．以上都不是78．下列关于 Km 的叙述哪项是正确的： A ．通过 Km 的测定可鉴定酶的最适底物 B ．Km 是引起最大反应速度的底物浓度 C ．Km 是反映酶催化能力的一个指标 D ．Km 与环境的 pH 无关 E ．以上都不是D ．反应环境的 pH1/Km 越小，酶与底物亲和力越大79．关于变构调节的叙述错误的是： A ．变构效应剂结合于酶的变构部位 B ．含催化部位的亚基称催化亚基C ．变构酶的催化部位和变构部位可在同一亚基D ．变构效应剂与酶结合后影响 ES 的生成E ．以上都不是 80．全酶是指：A ．酶- 底物复合物BC ．酶- 辅助因子复合物 DE ．酶- 变构剂的复合物 B 型题：A ．抛物线型曲线BC ．矩形双曲线DE ．平行线1．温度与反应速度的关系曲线是： 2．pH 与反应速度的关系曲线一般是： 3．底物浓度与反应速度的关系曲线是：A ．不可逆性抑制B ．竞争性抑制C ．非竞争性抑制D ．反竞争性抑制E ．反馈抑制4．丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制是： 5．砷化物对巯基酶的抑制是： 6．对氨苯甲酸对四氢叶酸合成的抑制是：A ．底物浓度B ．酶浓C ．激活剂D ．pH 值E ．抑制剂7 ．影响酶与底物的解离：8 ．能使酶活性增加：9 ．酶被底物饱和时，反应速度与之成正比： 10 ．可与酶的必需基团结影响酶活性：A ．能较牢固地与酶活性中心有关必需基团结合B ．较牢固地与酶分子上一类或几类必需基团结合C ．占据酶活性中心阻止底物与酶结合D ．酶可以与底物和抑制剂同时结合E ．抑制剂能与酶 -底物复合物 [ES] 结合，不能与游离酶结合 11 ．竞争性抑制剂作用是：12．特异性不可逆性抑制作用是： 13．非特异性不可逆抑制作用是：．酶-抑制剂复合物 ．酶-产物复合物．钟型曲线 ．直线14．反竞争性抑制作用是： 15．非竞争性抑制作用是：A ．递氢作用B ．转氨基作用C ．转酮醇作用D ．转酰基作用E ．转运 C02 作用 16．CoA-SH 作为辅酶参与： 17．FMN 作为辅酶参与： 18．TPP 作为辅酶参与：19．生物素作为辅助因子参与： 20．磷酸比哆醛作为辅酶参与： A ．组织受损伤或细胞通透性增加 C ．酶合成增加 D E ．酶排泄受阻21．急性胰腺炎时尿中淀粉酶升高是由于：22．急性传染性肝炎时血中转氨酶升高是由于： 23．严重肝病时血清凝血酶原降低是由于：24．前列腺癌时血清酸性磷酸酶活性升高是由于： 25．胆管结石时血中碱性磷酸酶活性可升高是由于： （三）问答题1．以酶原的激活为例说明蛋白质结构与功能的关系。
05-酶的化学修饰
（二）酶蛋白主链的修饰 ——主要是靠酶法进行修饰，用 蛋白酶对主联进行部分水解，可 以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰 ——通过选择性修饰催化活性氨 基酸的侧链来实现氨基酸残基的 取代，使一种氨基酸侧链转化为 另一种氨基酸侧链，这种方法又 称为化学突变法。
（四）肽链伸展后的修饰 ——酶蛋白经过脲、盐酸胍处理， 使肽链充分伸展，对酶分子内部 的疏水基团进行修饰，然后在适 当条件下，重新进行折叠。
（三）酶的大分子修饰作用 ——非共价修饰 ——共价修饰
1、大分子非共价修饰
——利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互 作用，对酶进行有效的保护 ——例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定 于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连， 从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚 氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护 酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用， 排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶 的稳定性增加。
在基础酶学研究上
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定
酶蛋白的结构变化与运动
酶蛋白部分区域的构象状态 酶的作用机理与催化反应历程 酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态 酶的固定化技术 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上
—克服酶在体内的不稳定性
—消除或降低酶的抗原性 —有助于酶分子到达并集中于病灶细胞 在工业上的应用
第五章
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰
——在分子水平上对酶进行改造，以达 到改变结构和改性的目的。在体外将酶 分子通过人工的方法与一些化学物质， 特别是一些有生物相容性的物质进行共 价连接，从而改变酶的结构和性质。这 些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰 主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。
《酶蛋白的化学修饰》PPT课件
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2、反应条件的选择
除允许修饰能顺利进行外,还必须满足如下要求： ①不造成蛋白质的不可逆变性。 ②有利于专一性修饰蛋白质。
为此,反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下 进行。反应的温度、pH都要小心控制。反应介质和缓冲液组成也要有所考 虑。
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②选择不同的反应pH 蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。所以控制不同的反
应pH，也就控制了各功能基的解离程度,从而有利于修饰的专一性。
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例如：
碘代乙酸对蛋白质进行修饰时,试剂可与半 胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及α-氨基、 ε-氨基发生作用。
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③利用某些产物的不稳定性 ④亲和标记 ⑤差别标记 ⑥利用蛋白质状态的差异
3）肝素
肝素有抗凝血、抗血栓、降血脂活性，适 于修饰溶栓酶类以增加疗效。 碳二亚胺法
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5）白蛋白
碳二亚胺法
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第三节 酶的亲和修饰
亲和标记 (Affinity Labeling） 亲和标记是最有意义的一种化学修饰，这
是因为它可以很专一性地作用于酶的活性部位。 亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆地结合在 酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位特定基 团，一般是必需基团，而造成不可逆失活。亲 和标记修饰剂一般是底物类似物，和底物含有 共同的结合于酶的基团。
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第二节 酶蛋白侧链的化学修饰
1、蛋白质侧链上的功能基主要有:
氨基（N端，赖氨酸，精氨酸）， 巯基（半胱氨酸）， 羧基（天冬氨酸、谷氨酸）， 甲硫基（甲硫氨酸）， 咪唑基（组氨酸）， 吲哚基 胍基
第三章第三节酶的化学修饰ppt课件
9）、二硫键的修饰
2、酶分子表面的化学修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精 细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。
水溶性大分子： ＰＥＧ及其衍生物：是线性分子，具有良好的生物相容性和水
溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗 原性。 右旋糖酐及其衍生物：右旋糖苷是由α—葡萄糖通过α—1， 6—糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和 水溶性。 糖肽：糖肽是蛋白酶水解人纤维蛋白或Y一球蛋白所得到的产 物。其分子上具有游离氨基，活化后与酶分子上氨基反应，从 而可修饰酶。 其他天然大分子（肝素、血清白蛋白） 其它合成大分子多聚物：聚N—乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇 （PVA）聚丙烯酸(PAA)饰的定义
通过化学方法对酶分子施行的各种改造和 修饰，以改变酶理化性质及生物活性的方法。
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用
范围。（70年代末之后） 1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2）保护酶活性部位与抗抑制剂 3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
如：PEG-腺苷脱氨酶、PEG-超氧化物歧化、 PEG-溶血类蛋白、PEG-天门冬酰氨酶、
缺点： 扩散速度受限； 生物活性降低； 选择性不高，稳定性不够理想。
极性氨基酸
1）无电荷的极性氨基酸（共7种）：
丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T),
酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),
天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),
酶的化学修饰法
酶的化学修饰方法通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、“剪切”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶分子的目的。
这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶化学修饰。
PEG化修饰聚乙二醇或甲基聚乙二醇有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5000 ~ 10000之间) , 无毒副作用, 无免疫原性, 具有良好的生物相容性。
1977 年 Abuchowski等[1]率先用 PEG修饰牛血蛋白BSA, 发现 PEG化的BSA保持了蛋白质的原有活性, 在体内的半衰期大大延长, 且无免疫原性。
其后人们利用PEG化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰。
PEG必须经活化才能用于脂肪酶的化学修饰。
活化的方法如图1所示.图1聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种pH中性, 无毒, 水溶性较高的亲水聚合物,其重复单元为氧乙烯基, 端基为两个羟基, 呈线性或支化链状结构[2]. PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物[3]。
姚文兵等[4] 用三光气和羟基琥珀酰亚胺对mPEG5000进行活化, 再对人干扰素α-2b进行了修饰研究, 反应方程式如Eq. 1所示.Goodson等[5]通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点, 采用马来酰亚胺活化的PEG (PEG-maleimide)对其进行修饰, 反应方程式如Eq. 2所示.[1]Abuchowski A, Van Es T, Palczuk C N, e t al . Ef f e ct of covalent at tach mentof polyethylene glycol on immun ogenicity and circulating life of bovine liver catalase [ J ] . J . Biol .Chem. , 1977 , 252: 3578- 3581.[2]Bailon, P.; Berthold, W.Pharm. Sci.Technol. Today 1998, 1, 352.[3]Hooftman, G.; Herman, S.; Schacht, E. J. Bioact. Compat. Polym. 1996, 11, 135.[4]Yao, W. B.; Lin, B. R.; Shen, Z. L.; Wu, W. T. Chin. J. Biochem. Pharm. 2001, 22, 289 (in Chinese).(姚文兵, 林碧蓉, 沈子龙, 吴梧桐, 中国生化药物杂志, 2001, 22, 289.)[5]Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/technology 1990, 8, 343.。
2021年公卫助理医师考点：第三章 酶
第三章酶第1讲酶的结构与功能【考频指数】★★★★【考点精讲】1.酶的分子组成（1）单纯酶：仅含氨基酸，如水解酶、清蛋白。
（2）结合酶：酶蛋白（蛋白质）+辅助因子[小分子有机化合物（辅酶）或金属离子]。
（3）酶蛋白：酶的蛋白质部分称为酶蛋白，决定酶反应特异性。
（4）辅酶：化学性质稳定的小分子有机化合物。
参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。
（5）辅基：辅酶中与酶蛋白共价结合的辅酶称为辅基，与酶蛋白结合紧密，不易分开。
酶的活性中心。
（6）必需基团：与酶活性发挥有关的化学基团。
（7）活性中心：这些必需基团与维持酶分子的空间构象有关。
酶分子中必需基团在空间位置上相对集中所形成的特定空间结构区域，是酶发挥催化作用的关键部位，称为酶的活性中心。
①活性中心可与作用物（底物）特异结合，将作用物转化为产物。
②活性中心上的必需基团包括结合基团和催化基团。
③活性中心外的必需基团维持酶活性中心空间构象。
2.酶促反应的特点（1）极高的催化效率：酶的高效催化是通过降低反应所需的活化能实现的。
（2）高度的特异性：一种酶只能作用于一种或一类化合物，催化进行一种类型的化学反应，得到一定的产物，这种现象称为酶的特异性。
（3）酶促反应具有可调节性。
【进阶攻略】弄清结合酶的构成以及各部分的作用，酶促反应的特点要牢记，活性中心简单了解，偶尔会考到。
【易错易混辨析】辅基属于辅酶，是与酶蛋白结合的辅酶。
辅酶透析方法可分，辅基不易分开。
【知识点随手练】一、A1型选择题1.酶的催化高效性是因为酶A.启动热力学不能发生的反应B.能降低反应的活化能C.能升高反应的活化能D.可改变反应的平衡点E.对作用物（底物）的选择性2.有关结合酶概念正确的是A.酶蛋白决定反应性质B.辅酶与酶蛋白结合才具有酶活性C.辅酶决定酶的专一性D.酶与辅酶多以共价键结合E.体内大多数脂溶性维生素转变为辅酶3.辅酶与辅基的差别在于A.辅酶与酶共价结合，辅基则不是B.辅酶参与酶反应，辅基则不参与C.辅酶含有维生素成分，辅基则不含D.辅酶为小分子有机物，辅基常为无机物E.经透析方法可使辅酶与酶蛋白分离，辅基则不能【知识点随手练参考答案及解析】一、A1型选择题1.【答案及解析】B。
酶的化学修饰
第四节 酶的亲和修饰
• 亲和标记：
• 又称专一性的不可逆抑制主要指的是修饰 剂具有与底物相类似的结构，对酶活性部 位具有高度的亲和性，能对活性部位的氨 基酸残基进行共价标记。
• 亲和试剂作为底物类似物应具有的条件： 1）在酶不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形 成可逆的复合物 2）没有反应性的竞争性的配体存在 3）试剂的体积不能过大，防止空间障碍的产 生 4）修饰产物稳定，有利于分析
• 酶的化学修饰（chemical modification）： 酶的化学修饰（chemical modification）： • 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价
结构发生改变。
• 酶选择性化学修饰： • 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
二、酶化学修饰的目的
第三章 酶的化学修饰
酶作为生物催化剂，其高效性和专 一性是其他催化剂无法比拟的，但是天 然酶的半衰期短，不稳定性等问题限制 了它的应用，如何延长半衰期，提高酶 的稳定性，降低抗原性等越来越引起人 们的关注了。酶的化学修饰是可以从分 子的水平上来改造酶，弥补天然酶缺陷 的一种重要的手段。
一、酶化学修饰的概念
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范 围。（70年代末之后） 围。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。 4）产生新的催化能力。
②化学修饰数据的分析
•
化学修饰的时间进程分析 根据获得的 时间进程曲线，可以了解修饰残基的性质 和数目、修饰残基与蛋白质生物活性之间 的关系等，实际是通过测定蛋白质的失活 速度常数的测定。大多实验中，修饰剂远 远多于被修饰的残基，可认为是假一级反 应，然后用残余活力的对数对时间作图， 得出失活常数。
生物化学试题 酶
第三章酶.三、典型试题分析1．一个酶作用于多种底物时，其天然底物的Km值应该是(1995年生化考题)A．最大 B．与其他底物相同 C．最小D．居中 E．与K3相同[答案] C2. 下列关于酶的活性中心的叙述哪些是正确的（1996年生化考题）A.所有的酶都有活性中心B. 所有的酶活性中心都含有辅酶C. 酶的必需基团都位于活性中心之内D. 所有抑制剂都作用于酶的活性中心E. 所有酶的活性中心都含有金属离子[答案] A3. 乳酸脱氢酶经透析后，催化能力显著降低，其原因是（1997年生化考题）A. 酶蛋白变形B. 失去辅酶C. 酶含量减少D. 环境PH值发生了改变E. 以上都不是[答案] B4. 关于酶的化学修饰，错误的是A. 酶以有活性（高活性），无活性（低活性）两种形式存在B. 变构调节是快速调节，化学修饰不是快速调节B.两种形式的转变有酶催化D. 两种形式的转变由共价变化E. 有放大效应[答案] B5. ．测定酶活性时，在反应体系中，哪项叙述是正确的A．作用物的浓度越高越好 B．温育的时间越长越好C．pH必须中性 D．反应温度宜以3713为佳E．有的酶需要加入激活剂[答案] E6．下列关于酶活性中心的叙述哪些是正确的(1999年生化试题)A．是由一条多肽链中若干相邻的氨基酸残基以线状排列而成B．对于整个酶分子来说，只是酶的一小部分C. 仅通过共价键与作用物结合 D．多具三维结构(答案] B和D7．酶的变构调节A．无共价键变化 B．构象变化C．作用物或代谢产物常是变构剂D．酶动力学遵守米式方程(答案) A、B和C8. 酶原之所以没有活性是因为(2000年生化试题)A. 酶蛋白肽链合成不完全 B．缺乏辅酶或辅基C. 活性中心未形成或未暴露D. 酶原是已经变性的蛋白质E. 酶原是普通的蛋白质[答案] C四、测试题(一)A型题1，下列对酶的叙述，哪一项是正确的?A．所有的蛋白质都是酶B，所有的酶均以有机化合物作为底物C. 所有的酶均需特异的辅助因子D．所有的酶对其底物都是有绝对特异性E．少数RNA具有酶一样的催化活性2．在常温常压及中性pH条件下，酶比一般催化剂的效率可高A．10～102倍 B．102～104倍巳104～108倍D．108～1012倍 E．1020倍以上3．以下哪项不是酶的特点A．多数酶是细胞制造的蛋白质B．易受pH，温度等外界因素的影响C．只能加速反应，不改变反应平衡点D．催化效率极高 E．有高度特异性4．下列哪种酶为结合酶A．淀粉酶 B．酯酶 C. 转氨酶D，核糖核酸酶 E．脲酶5．结合酶在下列哪种情况下才有活性A．酶蛋白单独存在 B．辅酶单独存在 C，亚基单独存在D．全酶形式存在 E，有激动剂存在6．下列哪种辅酶中不含核苷酸A．FAD B．FMN C，FH4 D．NADP+ E，CoASH7. 下列哪中种辅酶中不含维生素A. CoASH B．FAD C．NAD+ D．CoQ E. FMN8. 对340nm紫外光有吸收特性的辅酶是A. FADH2 B．NAD+ C．FMN D．TPP E. NADH9. 辅酶的作用机理主要在于A. 维持酶蛋白的空间构象 B。
第三章 酶的修饰方法
抗原诱导抗体酶的生物合成 抗体酶/催化性抗体是一种具有催化功能的抗体分子。
抗体是由抗原诱导产生的能与抗原特异结合的免疫球蛋白。
重链 哺乳动物有5种重链：α、δ、ε、γ和μ，对应组成的抗体为 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。 不同的重链在大小和组成上有所区别。 恒定区和可变区。 轻链 哺乳动物有2种轻链（λ型和κ型） 恒定区和可变区。 每个抗体包含的2条相同的轻链；哺乳动物抗体的轻链只有 一个型:κ或λ型。 Fc段和Fab段 Fc段抗体标记部位；ELISA 过程中抗体固定的部位，结合 二抗的部位。 Fab抗原结合部位。
具有高效的催化活性。一般抗体酶催化反应速度比非酶催化反应速 度快102-106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度。
抗体酶具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。
第二节 植物细胞培养产酶
植物是各种色素,药物，香精和酶等天然产物的主要来源。 目前已知的天然化合物30000多种，80%以上来自植物； 从植物中得到的药物有17类。 我国普遍使用的中草药及其制剂80%以上来自植物。 美国每年使用的植物来源的药物价值超过30亿美元。 植物来源的物质与人们生活密切相关。
增强子促进酶的生物合成
增强子是一段能够增强或促进基因转录的DNA序列。 1.比如，胰岛素基因增强子和胰凝乳蛋白酶基因的增强子都能够促进氯霉素乙酰 转移酶基因的表达（胰脏细胞） 2.NF-κB促进CASP9基因表达
增强子特点。 （1）无方向性； （2）不受增强子与其调控基因的之间距离影响。 （3）有些增强子有细胞和组织特异性。
第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节
酶合成原理：遵循中心法则。
酶生物合成的调节： 转录水平调节 蛋白翻译水平调节 激素水平调节 神经水平调节等， 但是到目前为止还没有完整的理论和模型来阐述动植物细胞中酶合成 的调节规律。
酶的化学修饰名词解释
酶的化学修饰名词解释
在生物化学中，酶是一类能够加速化学反应速率的蛋白质，它们起到了催化剂的作用。
酶的化学修饰，指通过化学手段对酶的部分或全部氨基酸残基进行改变，以改变酶的活性、稳定性或选择性。
常见的酶的化学修饰包括：
•磷酸化：在酶的氨基酸残基上添加磷酸基团，调控酶的活性和细胞信号传递。
•糖基化：在酶的氨基酸残基上添加糖基团，参与酶的稳定性和识别特异性。
•乙酰化：在酶的氨基酸残基上添加乙酰基团，影响酶的催化效率。
•甲基化：在酶的氨基酸残基上添加甲基基团，参与基因表达调控。
酶的化学修饰对于生物体的正常功能发挥至关重要，也是研究生物化学和药物开发领域的重要方向之一。
酶化学修饰
b 酶共价连接于载体上的固定化，原则上 可以增加酶分子的构象稳定性，防止酶构 象伸展而失活。但酶与载体的连接点必须 达到一定数目，才能使酶构象坚固稳定。
c 固定化能改变酶对底物的亲和力。如果载 体和底物带相反电荷的话，米氏常数（Km） 将降低；带相同电荷时， Km将增加。
一、化学修饰在酶的结构与功能 研究中的应用
3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量 当需要测定某一种氨基酸的数量时，就
可以定量的化学修饰方法，如用三硝基 苯磺酸测定氨基。
二、化学修饰酶在医学和 生物技术中的应用
作为生物催化剂的酶存在的问题： 酶是生物催化剂，它具有底物专一性强、
催化效率高和反应条件温和等显著特点， 但是与化学催化剂相比较,又有很多缺点
酶化学修饰
酶的表面化学修饰
大分子修饰 小分子修饰 交联修饰 固定化修饰
分子内部修饰 结合定点突变的化学修饰
1 酶的表面化学修饰
（1）大分子修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖
苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的 表面，形成一层覆盖层。要根据酶分子的 结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大 分子。
第三章 酶蛋白的化学 修饰
第六节 酶化学修饰的应用
酶分子修饰的目的：
研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金 属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响
提高酶的活力 增强酶的稳定性 降低或消除酶的抗原性
酶化学修饰的应用
化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 化学修饰酶在医学和生物技术中的应用 蛋白质化学修饰的局限性
肽链延伸后的修饰
用脲、盐酸胍或其他办法处理酶，使肽 链延伸，对内部疏水基团就行修饰，修饰 后重新折叠成具有催化活力构象。
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酶蛋白主要功能基团的修饰方法
八 甲硫氨酸甲硫基的修饰： 极性较弱，很难选择性修饰。
但可用过氧化氢、过甲酸等 氧化成甲硫亚砜。
酶的亲和修饰
亲和修饰: 修饰剂对被作用基团不仅具 有基团的专一性而且具有部位的专一 性,它们与底物有相类似的结构,对酶活 性部位具有高度的专一性,能对活性部 位的氨基酸残基进行共价标记,这类专 一性化学修饰称为亲和化学修饰(亲和 标记,专一性不可逆修饰)
酶蛋白主要功能基团的修二亚胺类特定 修饰酶的羧基成为最普遍 的标准方法.
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
二 氨基的化学修饰 氨基的烷基化已成为一种重要的赖氨酸
修饰方法,修饰剂包括有卤代乙酸、芳基 卤和芳香族磺酸。 三硝基苯磺酸（TNBS）是非常有效的一 种氨基修饰剂，它与赖氨酸残基反应， 产物在420nm和367nm处有特定的吸收。 常用的蛋白质氨基末端修饰剂有：2-4二 硝 基 氟 苯 （ DNFB ） 、 丹 磺 酰 氯 （DNS）、苯异硫氰酯（PITC）
链是最容易反应的。 目前已开发出很多基于碘乙酸的荧光试剂，马来
酰亚胺或马来酸酐类修饰剂能与巯基形成对酸稳 定的衍生物。反应产物在300nm处有最大光吸收； 有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基的专一性最 强，产物在250nm处有最大吸收。 5，5`-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB， Ellman试剂）也是最常用的巯基修饰剂。
蛋白质功能改变的解释:如果修饰发生在活 性部位或必需基团上;当修饰发生在远离活 性部位的氨基酸上.
酶活力的改变可能是由于米氏常数的改变 或最大反应速度的改变引起的.
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
蛋白质侧链主要功能基有:氨基, 羧基,巯基,咪唑基,酚基,吲哚基, 胍基,甲硫基等;
修饰反应主要有:酰化反应,烷基 化反应,氧化还原反应,芳香环取 代反应等;
利用具有两个反应活性部位的双功能 基团使相隔较近的两个氨基酸残基之 间或酶与其他分子之间发生交联反应， 这种修饰方法叫化学交联。
交联剂分为同型双功能试剂、异型双 功能试剂和可被光活化试剂三种类型。 每类中又分为可裂解型和不可裂解型。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
五 组氨酸咪唑基的修饰
常用的修饰剂有焦磷酸二 乙 酯 （ DPC ） 和 碘 代 乙 酸 ， 中性条件下有较好专一性， 形 成 的 产 物 在 240nm 上 有 最大吸收，可跟踪定量。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
六 色氨酸吲哚基的修饰：
N-溴代琥珀酰亚胺（NBS） 可以修饰吲哚基，并通过 280nm 处 光 吸 收 的 减 少 跟 踪反应，酪氨酸存在时能 干扰光的吸收测定。
肽链特定的基团的专一性修饰, 称
为选择性化学修饰.
目标
选择性
蛋白质共价结构变化=蛋白质化学修饰?
化学修饰的基本过程
首先是修饰剂和修饰条件的选择--提高修饰反应的专一性；
修饰过程的跟踪-----获得修饰反应 的数据；
最后是对数据进行分析----确定修 饰部位和修饰程度，对结果作出解 释并提出合理化的改进。
为什么要进行亲和标记?
亲和标记
亲和试剂应具有的特性:
①在使酶不可逆地失活前,亲和试剂要和酶形 成可逆复合物;
②亲和试剂的修饰程度是有限的; ③没有反应的竞争性配体的存在应减弱亲和
试剂的反应速度; ④亲和试剂的体积不能太大,否则会产生空间
障碍; ⑤修饰产物应该稳定,便于表征和定量.
酶的化学交联
2. 化学修饰数据的分析：
① 化学修饰的时间进程分析：
a) 追踪修饰过程光谱变化，或修饰过程对蛋白质 某些酶学参数（活性、变构配体的调节作用等） 的影响，从而获得修饰时间进程的曲线。
b) 可以了解修饰残基的性质和数目、修饰残基与 蛋白质生物活性之间的关系等
② 确定必需基团的数目和性质:
3. 化学修饰结果的解释
一 修饰反应专一性的控制
1. 试剂的选择:依赖修饰的目的.
修饰酶活性中心部位的氨基酸的试剂应该具备以 下特征：
①选择性地与一个氨基酸残基反应；
②反应在酶蛋白不变性的条件下进行；
③标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来， 进行鉴定；
④反应的程度能用简单的技术测定。
2. 反应条件的选择
原则：允许修饰反应能顺利进行，同 时不造成蛋白质的不可逆变性，有利 于专一性地修饰蛋白质。因此对反应 的温度、pH值、反应介质、缓冲液等 都要根据以上原则进行考虑。
3. 其他增强修饰反应专一性的方式：
① 利用蛋白质分子中某些基团的特殊性； ② 选择不同的反应pH值； ③ 利用某些产物的不稳定性； ④ 亲和标记； ⑤ 差别标记； ⑥ 利用蛋白质状态的差异。
修饰程度和修饰部位的测定
1. 分析方法：光谱法追踪最简单最有用， 但符合条件的试剂不多；目前最常用 的方法是间接法：测量被修饰的氨基 酸残基的量，要求修饰产物稳定，可 通过二次修饰增加其稳定性。
第三章 酶的化学修饰
广州大学生科院 柯德森
主要内容
基本概念 为什么? 修饰的策略 修饰的方法 修饰效果的分析 典型修饰例子:PEG的大分子表面修饰. 思考题
基本概念
化学修饰:凡通过化学基团的引入
或除去,而使蛋白质共价结构发生 改变,称为蛋白质的化学修饰.
选择性化学修饰: 利用化学试剂对
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
七 酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰： 四硝基甲烷（TNM）在温和条件下可
高度专一性地硝化酪氨酸酚基，生成 可电离发色基团，在酸水解条件下稳 定，可用于氨基酸定量分析。苏氨酸 和丝氨酸的专一性化学修饰剂比较少。 但丝氨酸蛋白水解酶中的丝氨酸残基 对二异丙基氟磷酸酯具有高度的反应 性。苯甲基磺酰氟也能与此酶的丝氨 酸残基作用。
PLP
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
三 精氨酸胍基的修饰
具有二个邻位羰基的化合物，如 丁二酮、1，2-环已二酮和苯乙 二醛是修饰精氨酸残基的重要试 剂。
具有光吸收性质的精氨酸残基修 饰剂主要有：4-羟基-3-硝基苯乙 二醛。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
四 巯基的化学修饰： 巯基具有很强的亲核性，含半胱氨酸的酶分子肽