第三章酶蛋白的化学修饰
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为什么要进行亲和标记?
亲和标记
亲和试剂应具有的特性:
①在使酶不可逆地失活前,亲和试剂要和酶形 成可逆复合物;
②亲和试剂的修饰程度是有限的; ③没有反应的竞争性配体的存在应减弱亲和
试剂的反应速度; ④亲和试剂的体积不能太大,否则会产生空间
障碍; ⑤修饰产物应该稳定,便于表征和定量.
酶的化学交联
第三章 酶的化学修饰
广州大学生科院 柯德森
主要内容
基本概念 为什么? 修饰的策略 修饰的方法 修饰效果的分析 典型修饰例子:PEG的大分子表面修饰. 思考题
基本概念
化学修饰:凡通过化学基团的引入
或除去,而使蛋白质共价结构发生 改变,称为蛋白质的化学修饰.
选择性化学修饰: 利用化学试剂对
一 修饰反应专一性的控制
1. 试剂的选择:依赖修饰的目的.
修饰酶活性中心部位的氨基酸的试剂应该具备以 下特征：
①选择性地与一个氨基酸残基反应；
②反应在酶蛋白不变性的条件下进行；
③标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来， 进行鉴定；
④反应的程度能用简单的技术测定。
2. 反应条件的选择
原则：允许修饰反应能顺利进行，同 时不造成蛋白质的不可逆变性，有利 于专一性地修饰蛋白质。因此对反应 的温度、pH值、反应介质、缓冲液等 都要根据以上原则进行考虑。
2. 化学修饰数据的分析：
① 化学修饰的时间进程分析：
a) 追踪修饰过程光谱变化，或修饰过程对蛋白质 某些酶学参数（活性、变构配体的调节作用等） 的影响，从而获得修饰时间进程的曲线。
b) 可以了解修饰残基的性质和数目、修饰残基与 蛋白质生物活性之间的关系等
② 确定必需基团的数目和性质:
3. 化学修饰结果的解释
利用具有两个反应活性部位的双功能 基团使相隔较近的两个氨基酸残基之 间或酶与其他分子之间发生交联反应， 这种修饰方法叫化学交联。
交联剂分为同型双功能试剂、异型双 功能试剂和可被光活化试剂三种类型。 每类中又分为可裂解型和不可裂解型。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
一 羧基的化学修饰
水溶性的碳二亚胺类特定 修饰酶的羧基成为最普遍 的标准方法.
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
二 氨基的化学修饰 氨基的烷基化已成为一种重要的赖氨酸
修饰方法,修饰剂包括有卤代乙酸、芳基 卤和芳香族磺酸。 三硝基苯磺酸（TNBS）是非常有效的一 种氨基修饰剂，它与赖氨酸残基反应， 产物在420nm和367nm处有特定的吸收。 常用的蛋白质氨基末端修饰剂有：2-4二 硝 基 氟 苯 （ DNFB ） 、 丹 磺 酰 氯 （DNS）、苯异硫氰酯（PITC）
PLP
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
三 精氨酸胍基的修饰
具有二个邻位羰基的化合物，如 丁二酮、1，2-环已二酮和苯乙 二醛是修饰精氨酸残基的重要试 剂。
具有光吸收性质的精氨酸残基修 饰剂主要有：4-羟基-3-硝基苯乙 二醛。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
四 巯基的化学修饰： 巯基具有很强的亲核性，含半胱氨酸的酶分子肽
3. 其他增强修饰反应专一性的方式：
① 利用蛋白质分子中某些基团的特殊性； ② 选择不同的反应pH值； ③ 利用某些产物的不稳定性； ④ 亲和标记； ⑤ 差别标记； ⑥ 利用蛋白质状态的差异。
修饰程度和修饰部位的测定
1. 分析方法：光谱法追踪最简单最有用， 但符合条件的试剂不多；目前最常用 的方法是间接法：测量被修饰的氨基 酸残基的量，要求修饰产物稳定，可 通过二次修饰增加其稳定性。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
八 甲硫氨酸甲硫基的修饰： 极性较弱，很难选择性修饰。
但可用过氧化氢、过甲酸等 氧化成甲硫亚砜。
酶的亲和修饰
亲和修饰: 修饰剂对被作用基团不仅具 有基团的专一性而且具有部位的专一 性,它们与底物有相类似的结构,对酶活 性部位具有高度的专一性,能对活性部 位的氨基酸残基进行共价标记,这类专 一性化学修饰称为亲和化学修饰(亲和 标记,专一性不可逆修饰)
链是最容易反应的。 目前已开发出很多基于碘乙酸的荧光试剂，马来
酰亚胺或马来酸酐类修饰剂能与巯基形成对酸稳 定的衍生物。反应产物在300nm处有最大光吸收； 有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基的专一性最 强，产物在250nm处有最大吸收。 5，5`-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB， Ellman试剂）也是最常用的巯基修饰剂。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
七 酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰： 四硝基甲烷（TNM）在温和条件下可
高度专一性地硝化酪氨酸酚基，生成 可电离发色基团，在酸水解条件下稳 定，可用于氨基酸定量分析。苏氨酸 和丝氨酸的专一性化学修饰剂比较少。 但丝氨酸蛋白水解酶中的丝氨酸残基 对二异丙基氟磷酸酯具有高度的反应 性。苯甲基磺酰氟也能与此酶的丝氨 酸残基作用。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
五 组氨酸咪唑基的修饰
常用的修饰剂有焦磷酸二 乙 酯 （ DPC ） 和 碘 代 乙 酸 ， 中性条件下有较好专一性， 形 成 的 产 物 在 240nm 上 有 最大吸收，可跟踪定量。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
六 色氨酸吲哚基的修饰：
N-溴代琥珀酰亚胺（NBS） 可以修饰吲哚基，并通过 280nm 处 光 吸 收 的 减 少 跟 踪反应，酪氨酸存在时能 干扰光的吸收测定。
蛋白质功能改变的解释:如果修饰发生在活 性部位或必需基团上;当修饰发生在远离活 性部位的氨基酸上.
酶活力的改变可能是由于米氏常数的改变 或最大反应速度的改变引起的.
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
蛋白质侧链主要功能基有:氨基, 羧基,巯基,咪唑基,酚基,吲哚基, 胍基,甲硫基等;
修饰反应主要有:酰化反应,烷基 化反应,氧化还原反应,芳香环取 代反应等;
肽链特定的基团的专一性修饰, 称
为选择性化学修饰.
目标
选择性
蛋白质共价结构变化=蛋白质化学修饰?
化学修饰的基本过程
首先是修饰剂和修饰条件的选择--提高修饰反应的专一性；
修饰过程的跟踪-----获得修饰反应 源自文库数据；
最后是对数据进行分析----确定修 饰部位和修饰程度，对结果作出解 释并提出合理化的改进。
亲和标记
亲和试剂应具有的特性:
①在使酶不可逆地失活前,亲和试剂要和酶形 成可逆复合物;
②亲和试剂的修饰程度是有限的; ③没有反应的竞争性配体的存在应减弱亲和
试剂的反应速度; ④亲和试剂的体积不能太大,否则会产生空间
障碍; ⑤修饰产物应该稳定,便于表征和定量.
酶的化学交联
第三章 酶的化学修饰
广州大学生科院 柯德森
主要内容
基本概念 为什么? 修饰的策略 修饰的方法 修饰效果的分析 典型修饰例子:PEG的大分子表面修饰. 思考题
基本概念
化学修饰:凡通过化学基团的引入
或除去,而使蛋白质共价结构发生 改变,称为蛋白质的化学修饰.
选择性化学修饰: 利用化学试剂对
一 修饰反应专一性的控制
1. 试剂的选择:依赖修饰的目的.
修饰酶活性中心部位的氨基酸的试剂应该具备以 下特征：
①选择性地与一个氨基酸残基反应；
②反应在酶蛋白不变性的条件下进行；
③标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来， 进行鉴定；
④反应的程度能用简单的技术测定。
2. 反应条件的选择
原则：允许修饰反应能顺利进行，同 时不造成蛋白质的不可逆变性，有利 于专一性地修饰蛋白质。因此对反应 的温度、pH值、反应介质、缓冲液等 都要根据以上原则进行考虑。
2. 化学修饰数据的分析：
① 化学修饰的时间进程分析：
a) 追踪修饰过程光谱变化，或修饰过程对蛋白质 某些酶学参数（活性、变构配体的调节作用等） 的影响，从而获得修饰时间进程的曲线。
b) 可以了解修饰残基的性质和数目、修饰残基与 蛋白质生物活性之间的关系等
② 确定必需基团的数目和性质:
3. 化学修饰结果的解释
利用具有两个反应活性部位的双功能 基团使相隔较近的两个氨基酸残基之 间或酶与其他分子之间发生交联反应， 这种修饰方法叫化学交联。
交联剂分为同型双功能试剂、异型双 功能试剂和可被光活化试剂三种类型。 每类中又分为可裂解型和不可裂解型。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
一 羧基的化学修饰
水溶性的碳二亚胺类特定 修饰酶的羧基成为最普遍 的标准方法.
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
二 氨基的化学修饰 氨基的烷基化已成为一种重要的赖氨酸
修饰方法,修饰剂包括有卤代乙酸、芳基 卤和芳香族磺酸。 三硝基苯磺酸（TNBS）是非常有效的一 种氨基修饰剂，它与赖氨酸残基反应， 产物在420nm和367nm处有特定的吸收。 常用的蛋白质氨基末端修饰剂有：2-4二 硝 基 氟 苯 （ DNFB ） 、 丹 磺 酰 氯 （DNS）、苯异硫氰酯（PITC）
PLP
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
三 精氨酸胍基的修饰
具有二个邻位羰基的化合物，如 丁二酮、1，2-环已二酮和苯乙 二醛是修饰精氨酸残基的重要试 剂。
具有光吸收性质的精氨酸残基修 饰剂主要有：4-羟基-3-硝基苯乙 二醛。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
四 巯基的化学修饰： 巯基具有很强的亲核性，含半胱氨酸的酶分子肽
3. 其他增强修饰反应专一性的方式：
① 利用蛋白质分子中某些基团的特殊性； ② 选择不同的反应pH值； ③ 利用某些产物的不稳定性； ④ 亲和标记； ⑤ 差别标记； ⑥ 利用蛋白质状态的差异。
修饰程度和修饰部位的测定
1. 分析方法：光谱法追踪最简单最有用， 但符合条件的试剂不多；目前最常用 的方法是间接法：测量被修饰的氨基 酸残基的量，要求修饰产物稳定，可 通过二次修饰增加其稳定性。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
八 甲硫氨酸甲硫基的修饰： 极性较弱，很难选择性修饰。
但可用过氧化氢、过甲酸等 氧化成甲硫亚砜。
酶的亲和修饰
亲和修饰: 修饰剂对被作用基团不仅具 有基团的专一性而且具有部位的专一 性,它们与底物有相类似的结构,对酶活 性部位具有高度的专一性,能对活性部 位的氨基酸残基进行共价标记,这类专 一性化学修饰称为亲和化学修饰(亲和 标记,专一性不可逆修饰)
链是最容易反应的。 目前已开发出很多基于碘乙酸的荧光试剂，马来
酰亚胺或马来酸酐类修饰剂能与巯基形成对酸稳 定的衍生物。反应产物在300nm处有最大光吸收； 有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基的专一性最 强，产物在250nm处有最大吸收。 5，5`-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB， Ellman试剂）也是最常用的巯基修饰剂。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
七 酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰： 四硝基甲烷（TNM）在温和条件下可
高度专一性地硝化酪氨酸酚基，生成 可电离发色基团，在酸水解条件下稳 定，可用于氨基酸定量分析。苏氨酸 和丝氨酸的专一性化学修饰剂比较少。 但丝氨酸蛋白水解酶中的丝氨酸残基 对二异丙基氟磷酸酯具有高度的反应 性。苯甲基磺酰氟也能与此酶的丝氨 酸残基作用。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
五 组氨酸咪唑基的修饰
常用的修饰剂有焦磷酸二 乙 酯 （ DPC ） 和 碘 代 乙 酸 ， 中性条件下有较好专一性， 形 成 的 产 物 在 240nm 上 有 最大吸收，可跟踪定量。
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
六 色氨酸吲哚基的修饰：
N-溴代琥珀酰亚胺（NBS） 可以修饰吲哚基，并通过 280nm 处 光 吸 收 的 减 少 跟 踪反应，酪氨酸存在时能 干扰光的吸收测定。
蛋白质功能改变的解释:如果修饰发生在活 性部位或必需基团上;当修饰发生在远离活 性部位的氨基酸上.
酶活力的改变可能是由于米氏常数的改变 或最大反应速度的改变引起的.
酶蛋白主要功能基团的修饰方法
蛋白质侧链主要功能基有:氨基, 羧基,巯基,咪唑基,酚基,吲哚基, 胍基,甲硫基等;
修饰反应主要有:酰化反应,烷基 化反应,氧化还原反应,芳香环取 代反应等;
肽链特定的基团的专一性修饰, 称
为选择性化学修饰.
目标
选择性
蛋白质共价结构变化=蛋白质化学修饰?
化学修饰的基本过程
首先是修饰剂和修饰条件的选择--提高修饰反应的专一性；
修饰过程的跟踪-----获得修饰反应 源自文库数据；
最后是对数据进行分析----确定修 饰部位和修饰程度，对结果作出解 释并提出合理化的改进。