平板活菌计数法检测粪便中的肠道菌群_张艳

随着微生态学的发展, 微生态疗法通过调整肠道 菌群作为部分疾病的辅助治 疗已应用于临床。粪便 标本肠道菌群的定量检测方法 ) ) ) 平板活菌计数法 能够较好地判定其疗效以及肠道菌群是否存在失调 和失调的程度。此种方法计数的线性范围大, 能较好 的反映菌落的疏密程 度。重复性、平 行性好, 但操作 较繁琐, 且测定值常受各种因素 的影响, 需要操作者 有熟练的技术。作者经过多次重复试验, 掌握了采用 平板活菌计数法检测粪便标本肠道菌群的技术和技 巧, 并应用于北京佑安医院住院的 10例肝硬化患者, 现介绍如下:
* C orresponding author, E-m ai:l liu jun e66@ yahoo. com. cn
10- 1、10- 2、10- 3 , , 10- 9, 连同原 液共 10个稀释度。 每次稀释不同浓度时更换 T ip头, 稀释时 T ip 头禁止 碰到试管以及试管内的液体。
2008年 2月 第 29卷 第 1期
首 都 医科 大 学 学报 Journal of C apitalM ed ical U niversity
F eb. 2008 V o .l 29 N o. 1
平板活菌计数法检测粪便中的肠道菌群
# 技术方法 #
张 艳 1 刘均娥 1* 张 晶 2 陈 铭 3
( 1. 首都 医科大学护理学院; 2. 首都医科大学附属北京佑安医院人工肝治疗培训 中心; 3. 首都 医科大学附属北京佑安医院检验科 )
2) 标本的称量和稀释: 在称取标 本前, 分 别在 9 个灭菌 EP管里加入 0. 9mL的稀释液 ) ) ) 生理盐水待 用。用天平称取 0. 1 g的粪便于 EP 管中, 加入 0. 9m L 的生理盐水, 在振荡器上使之匀 浆, 标本稀释呈系列
基金项目: 首 都医 科大 学基 础-临床 合 作课 题 ( 2006 JL59 ) 资助 项 目, Supported by Basic and C l in ica l R esearch Foundation of Cap ital M ed ical U n iversity( 2006 JL59 )
1 材料和方法
1. 1 材料 1) 培养基: ¹ 厌氧培养基: TPY 培养基, MRSA 培
养基 (北京陆桥技术有限责任公司 ), KV 培养基 ( 北京 奥博星生物技术有限责任公司生产的布氏琼脂 ); º 需氧培养基: EM B培养基 ( 北京奥博星生物技术有限 责任公司 ), PZ 培养基 ( 北京陆桥技术有限责任公司 生产的 P fizer肠球菌选择性琼脂 )。
2) 仪器和设备: 2. 5 L OX IOD 厌氧罐、37 e 普通 培养箱、Ò级生物安全柜。 1. 2 方法
1) 标本的采集和运送: 本研究的样本来源于在北 京佑安医院住院的 10例肝硬化 患者, 采集每位患者 新鲜的自然排便 1 g 左右置于密闭的无菌便盒中, 常 温下快速送检, 最好在 30 m in内完成送检。
4) 菌落计数方法: 确定目的菌后, 根据平板上的 活菌计数和稀释度, 按活菌计数公式计数, 结果以每 g 粪便湿质量中菌落形成单位的 对数值表示 ( lg CFU / g)。每 mL 标本中 活菌集 落单 位即公 式 CFU /mL = (标本质量 + 稀释量 ) /标本质量 @ 稀释度 @菌落个 数 ( 或 @ 10) ( 稀释度即稀释倍数 ) 。
作者将此方法应用于健康成年人所获得的结果相比, 肠杆菌不变, 肠球菌增加, 双歧杆菌、类杆菌下降, 根 据文献 [ 1] 报道活菌计数判断菌群失调的程度标准, 属 Ó 度菌 群失 调。
3 讨论
目前肠道菌群分析的方法可归纳为 3大类: 培养 法、分子生物学方法和镜检法。培养法即平板活菌计 数法, 通过控制接种粪便质量的方法可以对肠道菌群 进行定量培养, 常用于肠道菌群方面的科学研究。为 了节省资源, 不是所有稀释度都要进行接种, 而是只 选择容易计数的稀释度进行接种。通过对培养结果 的多次观察和分析, 在 10- 7、10- 8、10- 9这 3个稀释度 进行接种后几乎不长任何菌落; 而 10- 1、10- 2、10- 3 3 个稀释度进行接种 后菌落生 长得比 较密集, 很难计 数。根据本研究的经验: 培养双歧杆菌、乳酸杆菌和 类杆菌 可以选择 10- 5、10- 6、10- 7 3 个稀释度进行接 种, 培养大肠杆菌可以选择 10- 3、10- 4、10- 5 3 个稀释 度进行接种, 培养肠球菌可以选择 10- 2、10- 3、10- 4 3 个稀释度进行接种。另外对所培养的菌落进行菌落 图片染色和镜检所得的革兰染色和菌的形态特征与
图 4 乳酸杆菌的形态特征 Fig. 4 M orpho log ic cha racter istics o f la c to ba c illus 100 @
图 5 类杆菌的形态特征 Fig. 5 M orpho log ic cha racter istics o fba c te ro ide s 100 @
文献报道 [ 2 ] 相符。 本研究所得的结果与文献报道 [ 3] 的肝硬化患者
存在不同程度肠道菌群失调, 主要表现为厌氧菌如双 歧杆菌、类杆菌、真杆菌下降相符。
本实验方法应用范围较广, 除了用于临床检验还 可以应用在畜牧业和水产养殖业等领域, 通过定量检 测目的菌发现肠道菌群的变化, 从而判断药物疗效并 指导实践, 在科学研究方面具有较强的实用价值。但 影响此方法结果的因素很多, 如标本的采集和运输、 送检时间、稀释过程中的无菌状态、稀释度的准确性 以及接种时标本量的精确性等, 这些细节需要检测人 员操作时加以严格遵守以确保获得预期的菌群培养 并正确判断和计算各种菌落的数量。
2 结果
2. 1 初步判断 培养结果出来后, 选取特征性菌落进行菌落图片
染色和镜检, 根据革兰染色和菌的形态特征来判断目 的菌: ¹ 大肠杆菌: 革兰阴性无芽孢杆菌, 一般为中等 大小杆菌, 端圆, 有长、短不 一形状 ( 图 1)。 º 肠球 菌: 革兰阳性 球菌, 菌体圆 形或椭 圆形, 成双 或成链 (图 2) 。 » 双歧杆菌: 革兰阳性 无芽孢杆菌, 菌体长 短和形态很不一致, 多有分叉, 常形成 Y 或 V 排列 (图 3) 。 ¼乳酸杆菌: 革兰阳性杆菌, 多数菌种菌体稍大, 直或微弯, 成双或短链排列 ( 图 4) 。 ½ 类杆菌: 革兰 阴性杆菌, 菌 体呈现 多态如 长、短 杆菌, 两端 染色稍 深, 中间染色稍浅 ( 图 5) 。 2. 2 菌群检测结果
3) 接种和培养: ¹ 接种: 取上述标本系列稀释液 0. 01 mL 分别接种于用于培养双歧杆菌、乳酸杆菌、类 杆菌、大肠杆菌和肠球菌的 TPY、MRSA、KV、EM B、PZ 选择性培养基上。每种稀释度接种 3滴, 计数时取其 菌落的平均数。 º 培养: 将 TPY、MRSA、KV 培养基放 在厌氧罐中, 放入厌氧产气袋封闭, 再放在 37 e 的孵 育箱中培养 48 h; 将 EM B、PZ 培养基直接放在 37e 的 孵育箱中培养 24 h, 一般肠杆菌培养 18 h即可完成。
图 2 肠球菌的形态特征 F ig. 2 Mo rpho log ic characte ristics o fe n te ro co ccus 100 @
图 3 双歧杆菌的形态特征 Fig. 3 M orpho log ic cha racter istics o fb ifidoba c te rium 100 @
4 参考文献
[ 1] 熊德鑫, 伍丽萍. 注意菌 群失 调检测 的方 法 [ J]. 中华 医 学杂志, 2005, 85: 2746- 2748.
[ 2] 李兰娟. 感 染 微 生 态学 [M ]. 北 京: 人 民 卫 生 出 版 社, 2002, 224: 90.
[ 3] 华静, 李继强, 曾民德, 等. 肝 硬化 患者 肠道 菌群 的研 究 [ J]. 中华肝脏病杂志, 1998, 6: 79- 81. (收稿日期: 2007 10 08)
10例肝硬化患者肠道菌群检测的结果为: 肠杆菌 ( 6. 1 ? 0. 9) , 肠球菌 ( 6. 2 ? 0. 9 ), 乳 酸杆菌 ( 7. 3 ? 0. 73 ) , 双歧杆菌 ( 7. 1 ? 0. 5), 类杆菌 ( 7. 3 ? 0. 5) , 与
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图 1 大肠杆菌的形态特征 F ig. 1 Mo rpho log ic cha racter istics o fe nห้องสมุดไป่ตู้te ro ba c te ria ce a e 100 @