纸层析法分离氨基酸 ppt课件

(3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸 距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置， 溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向 流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱 呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特 制滤纸。
（4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种 溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时， 可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展 开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系 统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。
纸层析法分离氨基酸
实验目的
1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析 法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、 鉴定及定量)。
2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及 鉴定)分析的方法。
精品资料
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溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使 用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、 碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等
4.pH值
溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的 极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的 含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。
按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环 行三种方式。
(1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因 毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好， 是最常用的展开方法，但展开时间较长。
(2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸 点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。 下行法展开速度快，但Rf值的重现性较差，斑点易扩散。
2.滤纸
不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的 水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同 型号的滤纸上进ຫໍສະໝຸດ Baidu层析时，所得到的Rf值也不相同。
此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值。
3.层析所用的溶剂
同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所 以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好 的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中 被分离组分的Rf之差最好大于0.05。
为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用 缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值。
5.温度
温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积.所以温度 的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。
6.展开方式
同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同 的展开方式进行层析时，所得到的Rf 值不相同。用下行法展 开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸 层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较 小。
溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值 表示：
Rf= X/ Y 式中X：溶质斑点中心的移动距离
Y：溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于分配系数。
不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由 此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。
(二) 影响Rf值的主要因素
1.物质的结构和极性
2. 物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大 的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。
分配层析
分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中 的分配情况不同而使之得到分离的方法。
分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 (固定相 和流动相)间分配系数的不同。
分配系数(K)的定义是： K=溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)
二、纸层析
(一) 原理
纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相， 而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。 展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相 之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数， 移动速度因此不同，从而达到分离的目的。
7.样品溶液中杂质
样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如： 氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf 值。
(三) 操作方法
1.样品处理
用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定 的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需 稀释。
2.点样
将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直 线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后 用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注 射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的 量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的 量为5-30μg。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷 风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否 则会出现斑点畸形现象。
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实验原理
层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。 1944 年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技 术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和 高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也 迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既 可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制 备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛 应用而又必不可少的分析工具之一。
3.平衡
点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液 系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经 平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中， 滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发， 从而改变溶剂系统的组成,严重影响层析效果。平衡一 般在密闭的层析缸内进行。
4.展开
平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液 面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另 一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标 记，晾干或用冷风吹干。