紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

姓名：张鑫淼班级：生工1301

一．实验目的

以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。

了解细菌抗药性突变株的筛选方法

二．实验材料

菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）

培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基

试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。

仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等

营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4

营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL

三．实验原理

以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。

链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。

四．实验内容与操作步骤

（一）出发菌株菌悬液的制备

1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h；

2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h；

3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液；

4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞；

5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。

（二）UV诱变

1. 将紫外灯打开，预热30min；

2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；

3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理5s、10s、15s、30s、45s，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；

4. 取0.5ml处理后的菌液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板进

行计数（避光培养）。

（三）链霉素抗性突变株的筛选、

1.取1ml诱变处理好的菌悬液接入20ml液体营养肉汤液体培养基进行后培养，37℃120rpm 摇瓶培养；

5. 对后培养以后的菌悬液进行适当稀释，分别取三个合适的稀释度个1ml，倾注营养琼脂平板，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。同时，选取合适浓度的菌悬液0.1ml,涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h，进行诱变后抗药菌落计数，观察紫外诱变的效果。

五．实验结果及分析

1.对平板菌落进行计数，并计算死亡率

死亡率=（照射前活菌数/ml—照射后活菌数/ml）/（照射前活菌数/ml）

2.对诱变前后药物平板进行计数，计算大肠杆菌链霉素抗性的突变频度。

自发突变频度=（诱变前样品中Str抗性菌数）/（诱变前活菌数）

诱变突变频度=（后培养以后样品中Str抗性菌数）/（后培养以后样品中的抗性菌数）