抗氧化活性实验方法

抗氧化活性实验方法（体外实验）

1、清除DPPH自由基能力的测定

称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对照。样品对DPPH 自由基的清除率用以下公式计算：

DPPH

()

12

1100%

A A

A

-

=-⨯

清除率

A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；

A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；

A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。

2、总还原能力的测定

在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL 蒸馏水和0.5mL FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。Vc作为阳性对照。

3、对Fe2+离子螯合能力的测定

分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：

Fe2+

()

12

1100%

A A

A

-

=-⨯

螯合率

A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；

A1—样品溶液反应后的吸光值；

A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。

4、超氧自由基（O2-）清除率的测定

采用邻苯三酚自氧化法测定。取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度（A x），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。按下式计算O2-清除率：

O 2-00

100%x A A A -=⨯清除率 A 0—空白对照液吸光度；A x —样品溶液吸光度。

5、羟自由基（•OH ）清除率的测定

利用H 2O 2与Fe 2+混合产生•OH ，在体系中加入水杨酸捕捉•OH 并产生有色物质，该物质在510nm 下有最大吸收。反应体系中含8.8mmol/L H 2O 2 1mL 、9mmol/L FeSO 4 1mL 、9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1mL ，不同浓度的样品溶液1mL 。最后加H 2O 2启动反应，37℃反应30min ，以蒸馏水为参比，在510nm 下测定各浓度的吸光度。考虑到样品本身的吸光值，以9mmol/L FeSO 4 1mL 、9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1mL ，不同浓度的样品溶液1mL 和1mL 蒸馏水作为样品的本底吸收值。按下式计算•OH 清除率： •OH 001100%x x A A A ⎛

⎫-=-⨯ ⎪⎝⎭

清除率 A 0—空白对照液的吸光度；

A x —加入样品溶液后的吸光度；

A x0—不加显色剂H 2O 2样品溶液本底的吸光度。