拟南芥硝酸调控基因突变体的图位克隆

拟南芥硝酸调控基因突变体的图位克隆

摘要：随着农田生态系统中氮肥的过量施用对生态系统造成的污染日益加重，提高作物对氮素的利用效率、减少氮肥对生态系统的污染成为目前的一个研究热点，迫切需要加强对调控NO3-的基因及其分子机理的研究。本研究对硝酸调控基因突变体进行筛选，并利用图位克隆技术对突变基因进行克隆，完成突变基因的初步定位，为下一步精确定位打下基础，进而发现调控硝酸代谢的新基因，并研究其功能和分子机理，为作物的高氮效利用提供理论依据。

关键词：拟南芥；硝酸调控基因突变体；突变体筛选；图位克隆

Map-based cloning of the nitrate regulatory mutant gene

in Arabidopsis thaliana

Abstract:The excessive application of nitrogenous fertilizer has exerted a severe threat on the ecosystem. Improving the nitrogen use efficiency of crops, reducing the pollution of nitrogen fertilizer on ecosystems has become a new hotspot of research globally, The urgent need is to strengthen the research of NO3-regulated genes and their molecular mechanism. This research is to verify one nitrate regulatory mutant and clone the corresponding gene. Further study including new gene’s function and molecular mechanism will be helpful to decipher the network of NO3- regulation pathway. This will provides more theoretical basis for breeding new varieties of crops with high nitrogen use efficiency. Key words:Arabidopsis thaliana; nitrate regulatory gene mutant; mutant screen; map-based cloning.

1 前言

氮素是植物生长发育所需要的最主要的大量元素之一，对作物最终产量的贡献为40%-50%，是植物体内蛋白质、核酸、磷脂和某些生长激素的重要组分之一[1]，

通过对植物光合作用、内源激素、水分吸收利用、体内抗氧化系统的影响直接或间接左右着植物的生长发育[2],因此施用氮肥可提高并保持作物的高产。氮素的缺乏一方面可导致植物生长缓慢,产量下降;另一方面可使粮食作物籽粒蛋白质含量下降,降低品质[3]。由于氮肥生产原料可直接来自大气,几乎不受限制,因此在过去的几十年里，在发达国家和一些发展中国家例如中国和印度，农业上的施氮量急剧增加[4]，使农业产量得到很大的提高。

然而，施到土壤中的氮肥并没有全部被作物吸收利用，相当一部分流失到环境中，造成了极大的资源浪费。研究表明，全球的氮肥有效利用率从1960年的80%下降到2000年的30% [5]；中国目前氮肥年施用量是2500万吨，是世界平均水平的3倍，但是氮肥的利用效率却只有30%。同时，氮肥的过量施用也带来了严重的环境问题。未被吸收的氮素通过地表径流、淋洗、以及挥发等途径流失，导致了地表水源的富氧化作用、饮用水的硝酸盐污染和土壤酸性化[6、7]；硝态氮的反硝化和铵态氮的挥发都可使氮素通过气体形式损失,并对大气造成污染,一方面导致温室效应,另一方面对臭氧层也有破坏作用。这些问题日趋明显，亟待解决。

提高氮肥利用率,减少浪费和污染,一是要通过改进氮肥品质和施肥技术，二是要提高植物对氮肥的吸收利用效率，而提高作物的氮素利用率是解决这些问题的关键。氮素利用率高的品种只需要较少的氮肥，就能获得并保持高产，从而可以降低施氮量，这样既节省能源，又减少环境污染，并且降低农民的土地投入成本。因此，培育高氮效的作物新品种对于发展可持续农业、改善生态环境和保持人类健康都具有非常重要的意义。近些年来，世界上的一些发达国家（如美国、英国等）和国际著名的公司（如孟山都、杜邦等）均设立了专门的作物氮素利用研究机构，以加强这方面的基础研究和新品种选育。我国在提高小麦、玉米等作物的氮素利用率方面也做了大量工作。但迄今为止在高氮效新品种选育方面的进展尚十分有限[8]，主要原因在于控制植物氮素吸收利用的过程和分子机制还不清楚。因此，迫切需要加强-的基因及其分子机理的研究。

对调控NO

3

植物能够吸收土壤中的NO3-、NH4+和有机氮，其中以NO3-形式为主。在NRT1和NRT2家族的NO3-转运蛋白的作用下，NO3-被植物的根所吸收并转运到细胞内；进入细胞后，被NO3-还原酶（NIA）还原成NO2-，然后由NO2-还原酶（NiR）将NO2-转变成NH4+，最后NH4+被同化，形成各种氨基酸[9-11]。NO3-既具有营养的作用，又是一个信号分子。NO3-处理拟南芥会在几分钟内诱导NO3-代谢途径中基因（NRT2.1，NIA1，NiR）的表达[12]，其它一些与碳代谢和能量代谢有关的基因也受到诱导[13]。植物对NO3-的长期效应则表现在根的生长、根系结构、根与地上部的比

率和发芽率等方面的变化[14，15]。

关于植物对氮相应的调控基因及机理，前人通过反向遗传学和系统分析的方法进行了研究[16，17]，已发现下面几个基因参与氮的调控，较早发现的是1个转录因子：ANR1，在最近几年又报道了NLA、AtCIPK8、AtCIPK23、microRNA167、LBD37/38/39和AtNLP7 [18]，Tsay实验室发现了植物的第一个NO3-感应基因NRT1.1[19]。

但长期以来，由于缺乏一个有效的正向遗传学方法，在调节NO3-的基因及机理方面的研究受到严重阻碍。世界上有多个实验室试图用受NO3-诱导的启动子构建NO3-突变体筛选系统，但鲜有能有效筛选出NO3-突变体的成功报道，主要原因在于调节NO3-的顺式元件和反式因子过多，难以找到有明显调控突变的单一突变体。Crawford实验室经过多年的努力，发现了第一个NO3-的顺式元件，并将之与一个单一的增强子片段和YFP相连接，从而开发合成了一个响应NO3-的启动子。利用这一启动子，设计了一套筛选NO3-调控突变体的方法。通过该方法已经筛选出了2个拟南芥突变体，并将其成功地克隆出来，经进一步鉴定，这两个基因都参与NO3-的调控[20]，证明该系统能有效地筛选出NO3-调控突变体。该系统采用的NO3-顺式元件和增强子片段长度都较短（分别为180bp、131bp），而且只响应NO3-，不响应NH4+，所以选出转录因子上游基因突变体的机率比用pNRT2.1::LUC系统选出的机率更大，选出的NO3-调控突变体类型会更多。

图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了。

目前，利用上述由NO3-顺式元件、增强子和YFP构建的NO3-调控突变体筛选系统开展的拟南芥突变体筛选工作，已经得到了2个新的突变体GD75和GD69，初步的测序结果表明这2个突变体不是已知调控基因突变造成的。

本实验利用图位克隆法对拟南芥NO3-调控突变体GD75的突变基因进行克隆：首先将以Col为背景的SS204-9经EMS诱变得到突变体，再将其与Col野生型回交两次（清除其它可能的突变）后得到突变体GD75（遗传分析表明该突变体是由隐性突变造成的），其NO3-调控基因（以A表示正常基因）经诱变发生了突变（以a表示突变基因），之后与Ler野生型（AA）杂交得到F1代（Aa）。F1代的两条同源染色体分别为携带突变基因a的Col染色体（Col-a）与携带正常基因A的Ler 染色体（Ler-A），之后F1经自交得到F2代，在此过程中同源的染色体可发生交叉