免疫组化ICH
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① 抗原提取和纯化
② 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）
③ 抗体效价检测和抗体纯化
④ 标记抗体
⑤ 细胞和组织切片标本的制备 ⑥ 免疫组织/细胞化学反应和显色 ⑦ 观察和记录结果
抗体(antibody)
多克隆抗体(polyclonal antibody)
纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔） 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度高于后 者。 能广泛用于石蜡包埋组织切片。
2．免疫组织化学的相关理论和技术
2.1
免疫组织化学的工作原理
抗体与其抗原特异性结合
通过化学反应使特异性抗体标记上显示剂，如酶，金属 离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 借助光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色 或电子密度等变化，从而确定抗原在组织、细胞内的定 位和含量。
2.2 免疫组织化学的全过程包括：
亲和免疫组化
葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替桥抗体 卵白素－生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一
Biotin-peroxidase Complex, ABC) 生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合， 形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成
常用的免疫酶（染色）方法
免疫酶标法
非酶标法：PAP法
PAP法主要染色原理 ： 用第二抗体作“桥梁”， 既与第一抗体结合，再与PAP 复合物联接，最后用底物显色 剂显色。
抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制， 但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持 一定比例。 在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因 此不能出现肉眼可见的反应。 （BIG BEE现象）
单克隆抗体(monoclonal antibody)
单克隆抗体是由一个B淋巴细胞克隆分泌的针对一种抗原决定簇的抗体。 大多数为小鼠Ig。其优点为特异性强、抗体产量高。但灵敏度逊于多抗。 单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇（这一抗原决定簇可以是 抗原分子上的无关抗原决定簇）。 在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。
ABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC
复合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗—ABC。最后 用底物显色剂显色。
１． 用链霉菌亲和素代替ABC复合物中的卵白素，则为： ＳＡＢＣ法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex) ２．将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称： ＬＳＡＢ法：labelled StreptAvidin-Biotin ３．用链霉亲和素连结辣根过氧化物酶，则为： ＳＰ法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 若用碱性磷酸酶标记链霉亲和素则称ＳＡＰ法。 若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，则称ＤＳ法 特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。
2.3
免疫组织化学组织细胞处理
切片前的准备工作
(1)载玻片的清洁：
市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，
凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2 h。 (2)切片粘合剂的种类
多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。
APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+ 50ml丙酮）：用镊子 夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包 好，室温或4℃保存备用。
常用标记物
1．酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：① 底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易 扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后， 不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的 酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、 碱性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。 2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用 的有异硫氰酸荧光素（ FITC ）、四甲基异硫氰酸罗达明 （TRITC）、PE等。 3．生物素 与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4．金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。
收波长为490nm，最大发射波长为520nm。
免疫荧光法分为直接法和间接法（二步法）。
二、免疫酶法
用酶标记抗体，在组织切片上进行特异的抗原
抗体反应后，用组织化学方法使标记的酶催化相应
的底物，生成有色产物，在显微镜下观察，可间接
地对抗原物质进行定位。标记抗体常用的酶有辣根
过氧化物酶、碱性磷酸酶等，以辣根过氧化物酶作 为标记物更常用。
石蜡组织切片中抗原性的修复：
A、化学方法： 胰蛋白酶（0.05～0.1% ，含0.1%CaCl2） 蛋白酶K B、物理方法 单纯加热法： 高压加热法： 微波方法： 柠檬酸盐缓冲液
2.4三步法 D、多步法
一、免疫荧光法
用荧光染料作为标记物，最常用的荧光素是异硫氰酸 荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)。将 FITC标记的特异性抗体和组织切片上的相应抗原结合， 在荧光显微镜下观察，FITC呈现黄绿色荧光，代表所 鉴定抗原的定位。FITC为黄褐色粉末或结晶，最大吸
免疫组织化学及其应用
概
述
1．免疫组织化学概念
免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞 化学，其主要原理是用荧光素、酶、胶体金等标记的抗体检 测细胞或组织内的相应抗原，经过组织化学的呈色反应之后， 用光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察，进行定性、 定位或定量分析。 通过免疫组织化学手段，凡是能作抗原、半抗原的物质， 如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病 原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其检出和 对其进行研究。
② 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）
③ 抗体效价检测和抗体纯化
④ 标记抗体
⑤ 细胞和组织切片标本的制备 ⑥ 免疫组织/细胞化学反应和显色 ⑦ 观察和记录结果
抗体(antibody)
多克隆抗体(polyclonal antibody)
纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔） 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度高于后 者。 能广泛用于石蜡包埋组织切片。
2．免疫组织化学的相关理论和技术
2.1
免疫组织化学的工作原理
抗体与其抗原特异性结合
通过化学反应使特异性抗体标记上显示剂，如酶，金属 离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 借助光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色 或电子密度等变化，从而确定抗原在组织、细胞内的定 位和含量。
2.2 免疫组织化学的全过程包括：
亲和免疫组化
葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替桥抗体 卵白素－生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一
Biotin-peroxidase Complex, ABC) 生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合， 形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成
常用的免疫酶（染色）方法
免疫酶标法
非酶标法：PAP法
PAP法主要染色原理 ： 用第二抗体作“桥梁”， 既与第一抗体结合，再与PAP 复合物联接，最后用底物显色 剂显色。
抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制， 但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持 一定比例。 在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因 此不能出现肉眼可见的反应。 （BIG BEE现象）
单克隆抗体(monoclonal antibody)
单克隆抗体是由一个B淋巴细胞克隆分泌的针对一种抗原决定簇的抗体。 大多数为小鼠Ig。其优点为特异性强、抗体产量高。但灵敏度逊于多抗。 单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇（这一抗原决定簇可以是 抗原分子上的无关抗原决定簇）。 在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。
ABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC
复合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗—ABC。最后 用底物显色剂显色。
１． 用链霉菌亲和素代替ABC复合物中的卵白素，则为： ＳＡＢＣ法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex) ２．将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称： ＬＳＡＢ法：labelled StreptAvidin-Biotin ３．用链霉亲和素连结辣根过氧化物酶，则为： ＳＰ法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 若用碱性磷酸酶标记链霉亲和素则称ＳＡＰ法。 若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，则称ＤＳ法 特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。
2.3
免疫组织化学组织细胞处理
切片前的准备工作
(1)载玻片的清洁：
市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，
凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2 h。 (2)切片粘合剂的种类
多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。
APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+ 50ml丙酮）：用镊子 夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包 好，室温或4℃保存备用。
常用标记物
1．酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：① 底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易 扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后， 不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的 酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、 碱性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。 2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用 的有异硫氰酸荧光素（ FITC ）、四甲基异硫氰酸罗达明 （TRITC）、PE等。 3．生物素 与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4．金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。
收波长为490nm，最大发射波长为520nm。
免疫荧光法分为直接法和间接法（二步法）。
二、免疫酶法
用酶标记抗体，在组织切片上进行特异的抗原
抗体反应后，用组织化学方法使标记的酶催化相应
的底物，生成有色产物，在显微镜下观察，可间接
地对抗原物质进行定位。标记抗体常用的酶有辣根
过氧化物酶、碱性磷酸酶等，以辣根过氧化物酶作 为标记物更常用。
石蜡组织切片中抗原性的修复：
A、化学方法： 胰蛋白酶（0.05～0.1% ，含0.1%CaCl2） 蛋白酶K B、物理方法 单纯加热法： 高压加热法： 微波方法： 柠檬酸盐缓冲液
2.4三步法 D、多步法
一、免疫荧光法
用荧光染料作为标记物，最常用的荧光素是异硫氰酸 荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)。将 FITC标记的特异性抗体和组织切片上的相应抗原结合， 在荧光显微镜下观察，FITC呈现黄绿色荧光，代表所 鉴定抗原的定位。FITC为黄褐色粉末或结晶，最大吸
免疫组织化学及其应用
概
述
1．免疫组织化学概念
免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞 化学，其主要原理是用荧光素、酶、胶体金等标记的抗体检 测细胞或组织内的相应抗原，经过组织化学的呈色反应之后， 用光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察，进行定性、 定位或定量分析。 通过免疫组织化学手段，凡是能作抗原、半抗原的物质， 如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病 原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其检出和 对其进行研究。