实验报告八 化学发光

课程名称：生物仪器分析 指导老师： 成绩：__________________________

实验名称： 化学发光免疫分析技术 实验类型：探究 同组学生姓名：

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）

三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤（必填）

五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析

七、讨论、心得

一、实验目的和要求 1、掌握超灵敏化学发光成像仪的操作方法。 二、实验内容和原理 内容：1、将酶点到NC 膜上，进行化学发光反应。 原理：1、发光免疫分析

是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。

2、发光

是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。

3、辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析

该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP ）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP ）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。

4、鲁米诺发光原理

三、主要仪器设备

超灵敏化学发光成像仪、NC膜

四、操作方法和实验步骤

1、点酶在NC膜上。

2、加入发光底物A及发光底物B溶液于膜上，1:1混合后立即使用，置室温反应。可在加入底物后2～30分钟读取发光信号。

3、打开分析仪器的电源、仪器自检后、调整机器的到待机工作状态。

4、检测

5、图像捕获机器的操作见仪器说明书。

五、实验数据记录和处理

图1 第一张NC膜发光情况图2 第二张NC膜发光情况

六、实验结果与分析

1、第一张不能看见我们组画的图案，我们组画图案的部位呈现一片空白的状态。这可能是反应的时候，这个地方跟反应用的袋子贴合，导致没有和反映也充分接触，导致没有显色。

2、第二张可以清楚的看到我们组画的图案。

3、反应的时候必须等到NC膜上的液体完全干透，否则会导致图案模糊不清，也会污染反应液。

4、两张膜上都有一些非常黑的点，这可能是由于画图案的时候，没有控制好蛋白用量导致。蛋白量过多就会导致过度曝光。

5、画图案时一定要戴手套，否则手上的蛋白很可能对实验结果产生影响。

七、讨论、心得

1、蛋白质实验

将蛋白质进行电泳分离，再转印到NC膜上，经1%BSA封闭半小时、然后用一抗识别膜上的蛋白质，37度反应1小时，再经酶标二抗识别NC膜上结合的一抗，洗膜后才能进行化学发光反应。

2、核酸实验

将核酸进行电泳分离，再转印到NC膜或者尼龙膜上，变性后来，经无关核酸及5%左右BSA封闭半小时、然后用核酸探针识别膜上的核酸条带，37度反应1小时，再经酶标二抗识别NC膜上结合的核酸探针，其探针中通常常有小分子半抗原标记，它被二抗识别并且二抗中就带有酶，洗膜后才能进行化学发光反应。

3、化学发光免疫分析法的优势

①灵敏度高

灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性，其灵敏度可达 10-22 mol/L （ RIA 为 10 -12 mol/L ）。化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。

②宽的线性动力学范围

发光强度在 4 ～ 6 个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）为 2.0 的范围相比，优势明显。虽然 RIA 也有较宽的线性动力学范围，但放射性限制了其应用。

③光信号持续时间长

辉光型的 CLIA 产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了实验操作及测量。

④分析方法简便快速

绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。

⑤结果稳定、误差小

样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。

⑥安全性好及使用期长

免除了使用放射性物质。到目前为止，还未发现其危害性；试剂稳定，保存期可达六个月至一年以上。