自体皮肤成纤维细胞在医学美容中的应用研究
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１３００２１， Ｊ ｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂ ｓ ｔｒａｃｔ： Ｏｂ ｊｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｖｉｄ ｅ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｂ ｌｅ ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂ ａｓ ｉｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｌｏｇ ｏｕｓ ｓ ｋｉｎ ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｐ ｐ ｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄ ｉｃｉｎｅ ｃｏｓ ｍｅｔｏｌｏｇ ｙ． Ｍｅｔｈ ｏ ｄ ｓ Ｕｓ ｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｍｏｄ ｅｌ ｏｆ ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｒｅｐ ａｉｒ ｉｎ ｔｒａｕｍａ， ｐ ｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｒｅｓ ｅａｒｃｈｅｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇ ｏｕｓ ｓ ｋｉｎ ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ｉｎ ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｃｉｃａｔｒｉｃｌｅ ａｎｄ ｗｒｉｎｋｌｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｉｍａｌ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ． Ｒｅｓ ｕ ｌｔｓ Ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｇ ｒｏｕｐ ， Ｉ ａｎｄ ＩＩＩ ｃｏｌｌａｇ ｅｎ ｐ ｏｓ ｉｔｉｖｅ ｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｏｓ ｅ ｏｆ ｓ ｃａｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇ ｒｏｕｐ ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｙｐ ｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇ ｅｎ ｐ ｏｓ ｉｔｉｖｅ ｅｘｐ ｒｅｓ ｓ ｉｏｎ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｏｂ ｖｉｏｕｓ ｔｈａｎ ｔｙｐ ｅ ＩＩＩ ｃｏｌｌａｇ ｅｎ． Ｃｏ ｎ ｃｌｕ ｓ ｉｏ ｎ Ａｆｔｅｒ ｒｅｉｎｊｅｃｔｉｎｇ ｂ ａｃｋ ｔｏ ｔｈｅ ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｓ ｃａｒ， ａｕｔｏｌｏｇ ｏｕｓ ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ｓ ｅｃｒｅｔ ａｎｄ ｓ ｙｎｔｈｅｓ ｉｚｅ ｔｙｐ ｅ Ⅰａｎｄ ｔｙｐ ｅ ＩＩＩ ｃｏｌｌａｇ ｅｎ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｉｔ ｏｂ ｖｉｏｕｓ ｌｙ ｉｍｐ ｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｓ ｃａｒｓ ． Ａｕｔｏｌｏｇ ｏｕｓ ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ｃａｎ ｂ ｅ ａｐ ｐ ｌｉｅｄ ｉｎ ｍｅｄ ｉｃｉｎｅ ｃｏｓ ｍｅｔｏｌｏｇ ｙ， ｓ ｕｃｈ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓ ｃａｒｓ ａｎｄ ｃｏｓ ｍｅｔｏｌｏｇ ｙ ｐ ａｃｋｉｎｇ ｗｒｉｎｋｌｅ． Ｋｅｙ ｗ ｏ ｒｄ ｓ ：ｓ ｋｉｎ；ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ；ｃｏｌｌａｇ ｅｎ；ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｓ ｃａｒ
赵 娟， 李相军， 于晓艳， 苗春生， 罗际巡， 高海成， 任立群 （ 吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室 吉林 长春 １３００２１）
［ 摘要］ 目的： 为自体皮肤成纤维细胞（ ｆ ｉ ｂｒ ｏｂｌ ａｓ ｔ ｓ ， Ｆｂｓ） 在医学美容中的应用提 供 可 靠 的 科 学 依 据 。 方 法 ： 采 用 自 体 皮 肤 Ｆｂｓ 的体外培养以及 Ｆｂｓ 对凹陷性创伤模型的修复， 从细胞水平和整体动物水平对自体 Ｆｂｓ 在凹陷性瘢痕中的作用进行了初步研 究。结果： 注射细胞侧皮肤真皮层中 Ｆｂｓ 数量及Ⅰ型和Ⅲ型胶原的阳性表达均较瘢痕对照侧多而浓重， 而且Ⅰ型胶原阳性表达 比Ⅲ型更明显。结论： 回注到凹陷性瘢痕真皮层内的自体 Ｆｂｓ 能分泌和合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原， 能明显促进凹陷性瘢痕的修复， 自体 Ｆｂｓ 可应用于医学美容， 如瘢痕修复及除皱术中。 ［ 关键词］ 皮肤； 成纤维细胞； 胶原蛋白； 凹陷性瘢痕 ［ 中图分类号］ Ｒ６２２ ［ 文献标识码］ Ａ ［ 文章编号］ １００８－ ６４５５（ ２００８） ０２－ ０４
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２００６ ，３１，３４２（１）：２８－３５． ［６］胡大海，陈壁．基质金属蛋白酶在皮肤创面愈合中的作用［Ｊ］．中华
烧伤外科，２００１，１７（５）：３１７－３２０．
Ｎｅｕｒｏｌ，２００５， ６４（１１），９９１－９９７． ［２］Ｐｉｖａｒｃｓｉ Ａ， Ｂｏｄａｉ Ｌ， Ｒｅｔｈｉ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ
２ 结果 ２．１ 凹陷性创伤修复的观察：造模 ３ｈ 后，见大鼠 伤口已止血；至第 ３ 天伤口皮肤干燥结痂；１０ 天左 右背部凹陷性瘢痕已基本形成，表现为线状瘢痕且 较正常皮肤区域低陷。注射细胞前观察两侧瘢痕无 明显差别；注射细胞 ７ 天后观察发现，注射细胞侧 瘢痕较瘢痕对照侧明显变浅，颜色变淡，与正常皮 肤相比低陷情况有所改善；注射细胞 ３０ 天后，大鼠 背部瘢痕较进一步改善，注射细胞侧瘢痕基本消 失，与正常皮肤颜色和高度基本一致（如图 １ 所示）。 ２．２ 形态学观察：ＨＥ 染色观察结果发现，在瘢痕对 照侧皮肤真皮层内，细胞均呈长梭形，细胞核呈淡 蓝色，细胞浆呈粉红色；注射细胞 ７ 天后观察发现， 注射细胞侧皮肤真皮层内细胞数量较瘢痕对照侧 明显增多；而注射细胞 ３０ 天后，注射细胞侧及瘢痕 对照侧在真皮层中的细胞表达数量均较注射细胞 ７ 天时增多（如图 ２ 所示）。 ２．３ Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化染色：Ⅰ型和Ⅲ型胶 原染色，除胶原纤维呈棕黄色阳性反应外，真皮层 中 Ｆｂｓ 亦呈阳性反应，表现为胞浆内呈现棕黄色物 质围绕于核周围，而胞核不着色。观察Ⅰ型胶原免 疫组化染色结果发现，Ⅰ型胶原各组间面积分数比 较均有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；注射细胞 ７ 天后在 瘢痕对照侧胶原染色的阳性表达较注射细胞侧为 弱；注射细胞 ３０ 天后，两侧瘢痕的 Ｆｂｓ 数量及胶原
天、３０ 天。乙醚麻醉后处死大鼠，取下实验部位皮 肤，留做组织学检测之用。 １．６ 大鼠凹陷性瘢痕主要观察指标 １．６．１ 形态学观察：常规 ＨＥ 染色标本制备：甲醛固 定，石蜡包埋，４μｍ 厚的切片，二甲苯脱蜡，梯度酒 精脱水，常规 ＨＥ 染色。 １．６．２Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化染色：采用 Ｓ－ＡＢＣ 法进行免疫组化染色，按试剂盒操作说明进行，一 抗滴加的Ⅰ型和Ⅲ型胶原山羊抗大鼠多克隆抗体 按 １：１００ 比例稀释，新鲜配置的 ＤＡＢ 显色液，室温 下显色约为 ３～５ ｍｉｎ，复染，封片。 １．６．３ 胶原阳性表达面积的测定：每只大鼠随机 选取 ５ 张皮肤切片，在皮肤真皮层随机选取 ５ 个视 野（×４００），利用计算机图象分析系统，通过 ＴＤ８０１ 形 态 学 图 象 分 析 系 统 （Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０） 软 件 的 灰 度 调 节区别胶原和非胶原成分，计算胶原阳性表达面积 分数（﹪）。
成纤维细胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ｆｂｓ）是构成皮肤真 皮层的主要细胞，是真皮层产生胶原和其它 ＥＣＭ 的
主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的 结构和生理功能［１］。凹陷性瘢痕和皱纹均以皮肤真
基金项目：国家教育部留学归国人员启动基金资助课题（１９９９－３６３）；吉林大学创新基金资助课题（２００２） 通讯作者：任立群，教授，博士研究生导师；主要研究方向：心血管病分子病理与药理学研究；药效学及药物安全评价的病理学研究
中国美容医学 ２００８ 年 ２ 月第 １７ 卷第 ２ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｆｅｂ．２００８．Ｖｏｌ．１７．Ｎｏ．２
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在血管形成、促进创面愈合与组织修复、促进组织
［３］王 菲．ＴＬＲ 家族分子信号转导新进展［Ｊ］．国外医学免疫学分，２００５，２８
１ 材料和方法 １．１ 实验动物：Ｗｉｓｔａｒ 雄性大鼠 ８ 只，体重 ０．２５～ ０．３０ｋｇ，由吉林大学白求恩医学部动物部提供。 １．２ 主要试剂：ＲＰＭＩ－１６４０ 培养基干粉、Ⅳ型胶原 酶购自美国 Ｇｉｂｃｏ 公司；ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ山羊抗大鼠多 克隆抗体、ｃｏｌｌａｇｅｎ Ⅲ山羊抗大鼠多克隆抗体、生 物素标记二抗 ｌｇＧ 购自武汉博士德生物工程公司； Ｓ－ＡＢＣ 免疫组织化学试剂盒、ＤＡＢ 显色试剂盒购自 福州迈新生物技术公司。 １．３ 凹陷性创伤模型建立：按李荟元等［２－３］的动物 瘢痕造模方法，以手术切割方法建立大鼠凹陷性创 伤模型。具体方法如下：大鼠经乙醚麻醉后，将其固 定到固定台上，用脱毛剂脱去整个背毛，常规手术 消毒。在背部脊柱两侧各切除约 ３ｃｍ×３ｃｍ 皮肤及 深部肌层（对称）。创面用手术线缝合造成凹陷性瘢 痕。切创后，每只大鼠分笼饲养，注意清洁，防止伤 口感染。每日观察动物全身反应以及创面愈合情 况。将切下的皮肤进行 Ｆｂｓ 体外培养。 １．４ 皮肤 Ｆｂｓ 的分离和培养：本实验参考了 Ｃｌａｒｋ 等［４］及 Ｍｏｕｌｉｎ 等［５］Ｆｂｓ 体外培养方法，探索和建立 冷胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法对皮肤 Ｆｂｓ 进行体外培养。在超净工作台里，将手术切下的皮 肤经无菌 ｐＨ７．４ 的 ＰＢＳ 反复漂洗后，用 ０．２５﹪胰 蛋白酶消化，４ ℃冰箱过夜。次日，用无菌眼科剪子 和镊子，轻轻剪、刮去表皮和皮下肌肉及脂肪组织， 保留真皮。将皮肤组织剪碎，用 ０．２５％Ⅳ型胶原酶 ３７℃消化 ４ｈ。２００ 目筛网过滤，１０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ，去除上清加入含 １０﹪ＦＢＳ 的 ＲＰＭＩ－１６４０ 培养 液，轻轻吹打成细胞悬液。计数，细胞以 １×１０４ 的密 度接种到 ２５ｍｌ 的培养瓶，置于 ＣＯ２ 孵箱培养。静止 培养 ３ 天后，倒置显微镜下观察、换液，以后隔日换液。 １．５ 皮肤 Ｆｂｓ 的回注：待培养细胞传至 ３ 代，生长 汇合率达 ９０﹪以上时（约切创后 ２１ 天），用传代方 法进行消化、离心，再用 １ｍｌ ＰＢＳ 稀释成密度为 １× １０７ 个细胞 ／ｍｌ 悬液，注射到大鼠左侧瘢痕的真皮 层 （注射细胞侧）。以右侧瘢痕为对照 （瘢痕对照 侧），每日观察注射细胞后瘢痕变化情况，直至第 ７
Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｅｎｌｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
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中国美容医学 ２００８ 年 ２ 月第 １７ 卷第 ２ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｆｅｂ．２００８．Ｖｏｌ．１７．Ｎｏ．２
皮层结构发生改变、Ｆｂｓ 数量减少为特征。本实验采 用自体 Ｆｂｓ 的体外培养并利用凹陷性创伤模型，从 整体动物水平和细胞水平对自体 Ｆｂｓ 在凹陷性瘢 痕中的作用进行初步研究，以期为 Ｆｂｓ 在医学美容 除皱术中的应用提供可靠的科学依据。
再生方面起着重要的作用。ＶＥＧＦ 还是参与创面愈合 中介导炎性反应和肉芽组织形成有关的重要生长 因子。ＶＥＧＦ 是血管生成的主要调节因子，可以特异 性的作用于血管内皮细胞，发挥促分裂、趋化等作用。
（５）：３１３－３１６． ［４］Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｓｃｈｌｕｅｓｅｎｅｒ ＨＪ． Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ
Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ２ ａｎｄ ４ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００３，１５（６）：７２１－３０．
［收稿日期］２００７－１２－０４ ［修回日期］２００８－０２－０２
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编辑 ／ 张惠娟
基
础
研
·论 著·
究
自体皮肤成纤维细胞在医学美容中的应用研究
Ｔｈ ｅ ａ ｐ ｐ ｌｉｃ ａ ｔｉｏ ｎ ｒｅ ｓｅ ａ ｒｃ ｈ ｏ ｆ ａ ｕ ｔｏ ｌｏ ｇ ｏ ｕ ｓ ｓｋｉｎ ｆｉｂ ｒｏ ｂ ｌａ ｓｔｓ ｉｎ ｍ ｅ ｄ ｉｃ ａ ｌ ｃ ｏ ｓｍ ｅ ｔｏ ｌｏ ｇ ｙ
ＺＨＡＯ Ｊ ｕ ａｎ ，ＬＩ Ｘｉａｎ ｇ － ｊｕ ｎ ，ＹＵ Ｘｉａｏ － ｙａｎ ，ＭＩＡＯ Ｃｈ ｕ ｎ － ｓ ｈ ｅｎ ｇ ，ＬＵＯ Ｊ ｉ－ ｘｕ ｎ ，ＧＡＯ Ｈａｉ－ ｃｈ ｅｎ ｇ ，ＲＥＮ Ｌｉ－ ｑ ｕ ｎ （Ｄｅｐ ａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ ｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇ ｙ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｊ ｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ， Ｃｈａｎｇ ｃｈｕｎ
ｏｆ ｓｋｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
［ 参考文献］ ［１］Ｓｕ Ｙ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ｋ． ＴＬＲ ａｎｄ ＮＯＤ２ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｅｌｌ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｉｎｔａｃｔ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ［Ｊ］． Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ
ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２００６，６３（２４）：２９０１－２９０７． ［５］Ｏｕｊｉ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ，Ｓｈｉｒｏｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｗｎｔ－１０ｂ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ａｂ ｓ ｔｒａｃｔ： Ｏｂ ｊｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｖｉｄ ｅ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｂ ｌｅ ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂ ａｓ ｉｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｌｏｇ ｏｕｓ ｓ ｋｉｎ ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｐ ｐ ｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄ ｉｃｉｎｅ ｃｏｓ ｍｅｔｏｌｏｇ ｙ． Ｍｅｔｈ ｏ ｄ ｓ Ｕｓ ｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｍｏｄ ｅｌ ｏｆ ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｒｅｐ ａｉｒ ｉｎ ｔｒａｕｍａ， ｐ ｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｒｅｓ ｅａｒｃｈｅｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇ ｏｕｓ ｓ ｋｉｎ ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ｉｎ ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｃｉｃａｔｒｉｃｌｅ ａｎｄ ｗｒｉｎｋｌｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｉｍａｌ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ． Ｒｅｓ ｕ ｌｔｓ Ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｇ ｒｏｕｐ ， Ｉ ａｎｄ ＩＩＩ ｃｏｌｌａｇ ｅｎ ｐ ｏｓ ｉｔｉｖｅ ｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｏｓ ｅ ｏｆ ｓ ｃａｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇ ｒｏｕｐ ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｙｐ ｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇ ｅｎ ｐ ｏｓ ｉｔｉｖｅ ｅｘｐ ｒｅｓ ｓ ｉｏｎ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｏｂ ｖｉｏｕｓ ｔｈａｎ ｔｙｐ ｅ ＩＩＩ ｃｏｌｌａｇ ｅｎ． Ｃｏ ｎ ｃｌｕ ｓ ｉｏ ｎ Ａｆｔｅｒ ｒｅｉｎｊｅｃｔｉｎｇ ｂ ａｃｋ ｔｏ ｔｈｅ ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｓ ｃａｒ， ａｕｔｏｌｏｇ ｏｕｓ ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ｓ ｅｃｒｅｔ ａｎｄ ｓ ｙｎｔｈｅｓ ｉｚｅ ｔｙｐ ｅ Ⅰａｎｄ ｔｙｐ ｅ ＩＩＩ ｃｏｌｌａｇ ｅｎ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｉｔ ｏｂ ｖｉｏｕｓ ｌｙ ｉｍｐ ｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｓ ｃａｒｓ ． Ａｕｔｏｌｏｇ ｏｕｓ ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ｃａｎ ｂ ｅ ａｐ ｐ ｌｉｅｄ ｉｎ ｍｅｄ ｉｃｉｎｅ ｃｏｓ ｍｅｔｏｌｏｇ ｙ， ｓ ｕｃｈ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓ ｃａｒｓ ａｎｄ ｃｏｓ ｍｅｔｏｌｏｇ ｙ ｐ ａｃｋｉｎｇ ｗｒｉｎｋｌｅ． Ｋｅｙ ｗ ｏ ｒｄ ｓ ：ｓ ｋｉｎ；ｆｉｂ ｒｏｂ ｌａｓ ｔｓ ；ｃｏｌｌａｇ ｅｎ；ｄ ｅｐ ｒｅｓ ｓ ｅｄ ｓ ｃａｒ
赵 娟， 李相军， 于晓艳， 苗春生， 罗际巡， 高海成， 任立群 （ 吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室 吉林 长春 １３００２１）
［ 摘要］ 目的： 为自体皮肤成纤维细胞（ ｆ ｉ ｂｒ ｏｂｌ ａｓ ｔ ｓ ， Ｆｂｓ） 在医学美容中的应用提 供 可 靠 的 科 学 依 据 。 方 法 ： 采 用 自 体 皮 肤 Ｆｂｓ 的体外培养以及 Ｆｂｓ 对凹陷性创伤模型的修复， 从细胞水平和整体动物水平对自体 Ｆｂｓ 在凹陷性瘢痕中的作用进行了初步研 究。结果： 注射细胞侧皮肤真皮层中 Ｆｂｓ 数量及Ⅰ型和Ⅲ型胶原的阳性表达均较瘢痕对照侧多而浓重， 而且Ⅰ型胶原阳性表达 比Ⅲ型更明显。结论： 回注到凹陷性瘢痕真皮层内的自体 Ｆｂｓ 能分泌和合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原， 能明显促进凹陷性瘢痕的修复， 自体 Ｆｂｓ 可应用于医学美容， 如瘢痕修复及除皱术中。 ［ 关键词］ 皮肤； 成纤维细胞； 胶原蛋白； 凹陷性瘢痕 ［ 中图分类号］ Ｒ６２２ ［ 文献标识码］ Ａ ［ 文章编号］ １００８－ ６４５５（ ２００８） ０２－ ０４
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２００６ ，３１，３４２（１）：２８－３５． ［６］胡大海，陈壁．基质金属蛋白酶在皮肤创面愈合中的作用［Ｊ］．中华
烧伤外科，２００１，１７（５）：３１７－３２０．
Ｎｅｕｒｏｌ，２００５， ６４（１１），９９１－９９７． ［２］Ｐｉｖａｒｃｓｉ Ａ， Ｂｏｄａｉ Ｌ， Ｒｅｔｈｉ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ
２ 结果 ２．１ 凹陷性创伤修复的观察：造模 ３ｈ 后，见大鼠 伤口已止血；至第 ３ 天伤口皮肤干燥结痂；１０ 天左 右背部凹陷性瘢痕已基本形成，表现为线状瘢痕且 较正常皮肤区域低陷。注射细胞前观察两侧瘢痕无 明显差别；注射细胞 ７ 天后观察发现，注射细胞侧 瘢痕较瘢痕对照侧明显变浅，颜色变淡，与正常皮 肤相比低陷情况有所改善；注射细胞 ３０ 天后，大鼠 背部瘢痕较进一步改善，注射细胞侧瘢痕基本消 失，与正常皮肤颜色和高度基本一致（如图 １ 所示）。 ２．２ 形态学观察：ＨＥ 染色观察结果发现，在瘢痕对 照侧皮肤真皮层内，细胞均呈长梭形，细胞核呈淡 蓝色，细胞浆呈粉红色；注射细胞 ７ 天后观察发现， 注射细胞侧皮肤真皮层内细胞数量较瘢痕对照侧 明显增多；而注射细胞 ３０ 天后，注射细胞侧及瘢痕 对照侧在真皮层中的细胞表达数量均较注射细胞 ７ 天时增多（如图 ２ 所示）。 ２．３ Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化染色：Ⅰ型和Ⅲ型胶 原染色，除胶原纤维呈棕黄色阳性反应外，真皮层 中 Ｆｂｓ 亦呈阳性反应，表现为胞浆内呈现棕黄色物 质围绕于核周围，而胞核不着色。观察Ⅰ型胶原免 疫组化染色结果发现，Ⅰ型胶原各组间面积分数比 较均有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；注射细胞 ７ 天后在 瘢痕对照侧胶原染色的阳性表达较注射细胞侧为 弱；注射细胞 ３０ 天后，两侧瘢痕的 Ｆｂｓ 数量及胶原
天、３０ 天。乙醚麻醉后处死大鼠，取下实验部位皮 肤，留做组织学检测之用。 １．６ 大鼠凹陷性瘢痕主要观察指标 １．６．１ 形态学观察：常规 ＨＥ 染色标本制备：甲醛固 定，石蜡包埋，４μｍ 厚的切片，二甲苯脱蜡，梯度酒 精脱水，常规 ＨＥ 染色。 １．６．２Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化染色：采用 Ｓ－ＡＢＣ 法进行免疫组化染色，按试剂盒操作说明进行，一 抗滴加的Ⅰ型和Ⅲ型胶原山羊抗大鼠多克隆抗体 按 １：１００ 比例稀释，新鲜配置的 ＤＡＢ 显色液，室温 下显色约为 ３～５ ｍｉｎ，复染，封片。 １．６．３ 胶原阳性表达面积的测定：每只大鼠随机 选取 ５ 张皮肤切片，在皮肤真皮层随机选取 ５ 个视 野（×４００），利用计算机图象分析系统，通过 ＴＤ８０１ 形 态 学 图 象 分 析 系 统 （Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０） 软 件 的 灰 度 调 节区别胶原和非胶原成分，计算胶原阳性表达面积 分数（﹪）。
成纤维细胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ｆｂｓ）是构成皮肤真 皮层的主要细胞，是真皮层产生胶原和其它 ＥＣＭ 的
主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的 结构和生理功能［１］。凹陷性瘢痕和皱纹均以皮肤真
基金项目：国家教育部留学归国人员启动基金资助课题（１９９９－３６３）；吉林大学创新基金资助课题（２００２） 通讯作者：任立群，教授，博士研究生导师；主要研究方向：心血管病分子病理与药理学研究；药效学及药物安全评价的病理学研究
中国美容医学 ２００８ 年 ２ 月第 １７ 卷第 ２ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｆｅｂ．２００８．Ｖｏｌ．１７．Ｎｏ．２
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在血管形成、促进创面愈合与组织修复、促进组织
［３］王 菲．ＴＬＲ 家族分子信号转导新进展［Ｊ］．国外医学免疫学分，２００５，２８
１ 材料和方法 １．１ 实验动物：Ｗｉｓｔａｒ 雄性大鼠 ８ 只，体重 ０．２５～ ０．３０ｋｇ，由吉林大学白求恩医学部动物部提供。 １．２ 主要试剂：ＲＰＭＩ－１６４０ 培养基干粉、Ⅳ型胶原 酶购自美国 Ｇｉｂｃｏ 公司；ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ山羊抗大鼠多 克隆抗体、ｃｏｌｌａｇｅｎ Ⅲ山羊抗大鼠多克隆抗体、生 物素标记二抗 ｌｇＧ 购自武汉博士德生物工程公司； Ｓ－ＡＢＣ 免疫组织化学试剂盒、ＤＡＢ 显色试剂盒购自 福州迈新生物技术公司。 １．３ 凹陷性创伤模型建立：按李荟元等［２－３］的动物 瘢痕造模方法，以手术切割方法建立大鼠凹陷性创 伤模型。具体方法如下：大鼠经乙醚麻醉后，将其固 定到固定台上，用脱毛剂脱去整个背毛，常规手术 消毒。在背部脊柱两侧各切除约 ３ｃｍ×３ｃｍ 皮肤及 深部肌层（对称）。创面用手术线缝合造成凹陷性瘢 痕。切创后，每只大鼠分笼饲养，注意清洁，防止伤 口感染。每日观察动物全身反应以及创面愈合情 况。将切下的皮肤进行 Ｆｂｓ 体外培养。 １．４ 皮肤 Ｆｂｓ 的分离和培养：本实验参考了 Ｃｌａｒｋ 等［４］及 Ｍｏｕｌｉｎ 等［５］Ｆｂｓ 体外培养方法，探索和建立 冷胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法对皮肤 Ｆｂｓ 进行体外培养。在超净工作台里，将手术切下的皮 肤经无菌 ｐＨ７．４ 的 ＰＢＳ 反复漂洗后，用 ０．２５﹪胰 蛋白酶消化，４ ℃冰箱过夜。次日，用无菌眼科剪子 和镊子，轻轻剪、刮去表皮和皮下肌肉及脂肪组织， 保留真皮。将皮肤组织剪碎，用 ０．２５％Ⅳ型胶原酶 ３７℃消化 ４ｈ。２００ 目筛网过滤，１０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ，去除上清加入含 １０﹪ＦＢＳ 的 ＲＰＭＩ－１６４０ 培养 液，轻轻吹打成细胞悬液。计数，细胞以 １×１０４ 的密 度接种到 ２５ｍｌ 的培养瓶，置于 ＣＯ２ 孵箱培养。静止 培养 ３ 天后，倒置显微镜下观察、换液，以后隔日换液。 １．５ 皮肤 Ｆｂｓ 的回注：待培养细胞传至 ３ 代，生长 汇合率达 ９０﹪以上时（约切创后 ２１ 天），用传代方 法进行消化、离心，再用 １ｍｌ ＰＢＳ 稀释成密度为 １× １０７ 个细胞 ／ｍｌ 悬液，注射到大鼠左侧瘢痕的真皮 层 （注射细胞侧）。以右侧瘢痕为对照 （瘢痕对照 侧），每日观察注射细胞后瘢痕变化情况，直至第 ７
Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｅｎｌｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
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中国美容医学 ２００８ 年 ２ 月第 １７ 卷第 ２ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｆｅｂ．２００８．Ｖｏｌ．１７．Ｎｏ．２
皮层结构发生改变、Ｆｂｓ 数量减少为特征。本实验采 用自体 Ｆｂｓ 的体外培养并利用凹陷性创伤模型，从 整体动物水平和细胞水平对自体 Ｆｂｓ 在凹陷性瘢 痕中的作用进行初步研究，以期为 Ｆｂｓ 在医学美容 除皱术中的应用提供可靠的科学依据。
再生方面起着重要的作用。ＶＥＧＦ 还是参与创面愈合 中介导炎性反应和肉芽组织形成有关的重要生长 因子。ＶＥＧＦ 是血管生成的主要调节因子，可以特异 性的作用于血管内皮细胞，发挥促分裂、趋化等作用。
（５）：３１３－３１６． ［４］Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｓｃｈｌｕｅｓｅｎｅｒ ＨＪ． Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ
Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ２ ａｎｄ ４ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００３，１５（６）：７２１－３０．
［收稿日期］２００７－１２－０４ ［修回日期］２００８－０２－０２
Leabharlann Baidu
编辑 ／ 张惠娟
基
础
研
·论 著·
究
自体皮肤成纤维细胞在医学美容中的应用研究
Ｔｈ ｅ ａ ｐ ｐ ｌｉｃ ａ ｔｉｏ ｎ ｒｅ ｓｅ ａ ｒｃ ｈ ｏ ｆ ａ ｕ ｔｏ ｌｏ ｇ ｏ ｕ ｓ ｓｋｉｎ ｆｉｂ ｒｏ ｂ ｌａ ｓｔｓ ｉｎ ｍ ｅ ｄ ｉｃ ａ ｌ ｃ ｏ ｓｍ ｅ ｔｏ ｌｏ ｇ ｙ
ＺＨＡＯ Ｊ ｕ ａｎ ，ＬＩ Ｘｉａｎ ｇ － ｊｕ ｎ ，ＹＵ Ｘｉａｏ － ｙａｎ ，ＭＩＡＯ Ｃｈ ｕ ｎ － ｓ ｈ ｅｎ ｇ ，ＬＵＯ Ｊ ｉ－ ｘｕ ｎ ，ＧＡＯ Ｈａｉ－ ｃｈ ｅｎ ｇ ，ＲＥＮ Ｌｉ－ ｑ ｕ ｎ （Ｄｅｐ ａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ ｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇ ｙ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｊ ｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ， Ｃｈａｎｇ ｃｈｕｎ
ｏｆ ｓｋｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
［ 参考文献］ ［１］Ｓｕ Ｙ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ｋ． ＴＬＲ ａｎｄ ＮＯＤ２ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｅｌｌ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｉｎｔａｃｔ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ［Ｊ］． Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ
ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２００６，６３（２４）：２９０１－２９０７． ［５］Ｏｕｊｉ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ，Ｓｈｉｒｏｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｗｎｔ－１０ｂ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ