酶工程 动植物细胞培养产酶
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在原生质体制备过程中, 为了防止原生质体被破坏, 一般要采用用高渗溶 液, 以利于完整原生质体的释放。配制高渗溶液的溶质称为渗透压稳定剂。 常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。
20世纪80年代以后，植物细胞培养技术迅速发展, 已成为 生物工程研究开发的新热点。
主要内容
1. 植物细胞的特点 2. 植物细胞培养的特点 3. 植物细胞培养的工艺条件及其控制
植物细胞培养的工艺流程 植物细胞培养的培养基
4. 植物细胞培养产酶的工艺过程
一、植物细胞的特点
植物细胞结构
动物细胞模式图
动物细胞
获得：离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术 等
培养方式：悬浮培养、贴壁培养和微载体培养等
植物细胞
获得：机械捣碎、酶解和诱导愈伤组织的方法 培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等,在
次级代谢物的生产过程中通常采用液体悬浮培养。
第一节 植物细胞培养产酶
植物是各种色素、药物、香精和酶等天 然产物的主要来源：
三、植物细胞培养的工艺条件及其控制
（一） 植物细胞培养的工艺流程
一般为：
外植体-----细胞的获取-----细胞培养----分离纯化-----产物
1. 外植体的选择与处理
外植体：指从植株取出, 经过预处理后, 用于植物组织和细胞 培养的植物组织(包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子 等) 片段或小块。
2. 植物细胞的获取
直接分离法, 愈伤组织诱导法 原生质体再生法
直接分离法:
植物细胞可以直接从外植体中分离得到。分为机械法和酶 解法两种。
1）机械捣碎法分离植物细胞是先将叶片等外植体轻轻捣碎, 然 后通过过滤和离心分离细胞。
优点: 获得的植物细胞没有经过酶的作用, 不会受到伤害; 不需要经过质壁分离, 有利于进行生理和生化研究。
1. 提高产率 2. 缩短周期
植物细胞生长的倍增时间一般为12～60h, 一般生产周期15～30天。
3. 易于管理, 减轻劳动强度
不受地理环境和气候条件等的影响。
4. 提高产品质量
主要产物的产率较高, 杂质较少； 减少环境中有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀； 产物易于分离纯化。
5. 其他
对剪切力敏感、生产周期长等缺点； 许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。
核苷酸、酶等 多肽药、酶等
三者之间的差异主要有：
•植物细胞>动物细胞>微生物细胞。 •动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 •植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。 •植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的 光照。 •植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 •植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。
二、 植物细胞培养的特点
植物细胞培养技术首先从植物外植体中 选育出植物细胞, 再经过筛选、诱变、原 生质体融合或D N A 重组等技术而获得 优良的植物细胞。然后, 在人工控制条件 的植物细胞反应器中进行植物细胞培养, 从而获得各种所需的产物。
植物细胞培养生产各种天然产物, 与从植物中提 取分离这些物质相比, 具有如下显著特点。
原生质体再生法
原生质体再生法: 原生质体(protoplast) 是除去细胞壁后得到的微球体。
植物原生质体的获得：可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、 器官中获得。
分离方法：机械分离法和酶解法两种, 一般都采用酶解法。
酶解法：植物细胞的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。 为使细胞壁降解释放原生质体, 必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物 质水解的酶制剂, 最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。
缺陷： 由于受到机械的作用, 细胞结构会受到一定的伤害, 获得完整的细胞团或细胞数量少, 其使用不普遍。
2）酶解法分离细胞是利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体, 分 离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层, 而且 还能软化细胞壁。所以用酶解法分离细胞的时候, 必须对 细胞给予渗透压保护, 如甘露醇等。
植物、动物、微生物细胞的特性比较
细胞种类 植物细胞 微生物细胞 动物细胞
细胞大小/um 200～300
1～10
1Biblioteka Baidu～100
倍增时间/h ﹥12
0.3-6
﹥15
营养要求 简单
简单
复杂
光照要求 对剪切力
大多数要求 敏感
不要求 大多数不敏感
不要求 非常敏感
主要产物
色素、药物、 醇、有机酸、氨 疫苗、激素、 香精、酶等 基酸、抗生素、 单克隆抗体、
目前已知的天然化合物超过30 000种, 其中80 % 以上来自于植物; 从植物中得到的最普遍又必不可缺 的药物有17 类, 我国普遍使用的中草药及其制剂80 % 以上来源于植物,美国每年使用的植物来源的药物 超过30 亿美元; 全世界每年使用的植物来源的芳香化 合物的价值超过15 亿美元。
研发历史
愈伤组织诱导法
愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细 胞团。
通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的基本过程:
将选择好含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基加入 0.7 % ～0.8 % 的琼脂, 制成半固体的愈伤组织诱导培养基。 灭菌、冷却后, 将上述外植体植入诱导培养基中, 于25℃左 右培养一段时间, 即从外植体的切口部位长出小细胞团, 此 细胞团称之为愈伤组织。一般培养1～3 周后, 将愈伤组织 分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养, 以获得更多 的愈伤组织。
选择：首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植 株, 如果植物细胞是用于生产次级代谢物, 则需从产生该次 级代谢物的组织部位中切取一部分组织, 经过清洗, 除去表 面的灰尘污物。
操作：将上述外植体切成0. 5～1c m 左右的片段或小块, 用 70 % ～75 % 乙醇溶液或者5 % 次氯酸钠、10 % 漂白 粉、0. 1 % 升汞溶液等进行消毒处理, 再用无菌水充分漂 洗, 以除去残留的消毒剂。
1902 年, 哈勃兰德( Haberlandt) 首次提出分离植物 单细胞并将其培养成植株的设想, 100 年来, 随着培养 基的研制和培养技术的发展, 已经从200 多种植物中 分离出细胞, 不仅可以通过细胞的再分化生成完整的 植株, 而且可以通过细胞培养, 获得400 多种人们所需 的各种物质。
20世纪80年代以后，植物细胞培养技术迅速发展, 已成为 生物工程研究开发的新热点。
主要内容
1. 植物细胞的特点 2. 植物细胞培养的特点 3. 植物细胞培养的工艺条件及其控制
植物细胞培养的工艺流程 植物细胞培养的培养基
4. 植物细胞培养产酶的工艺过程
一、植物细胞的特点
植物细胞结构
动物细胞模式图
动物细胞
获得：离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术 等
培养方式：悬浮培养、贴壁培养和微载体培养等
植物细胞
获得：机械捣碎、酶解和诱导愈伤组织的方法 培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等,在
次级代谢物的生产过程中通常采用液体悬浮培养。
第一节 植物细胞培养产酶
植物是各种色素、药物、香精和酶等天 然产物的主要来源：
三、植物细胞培养的工艺条件及其控制
（一） 植物细胞培养的工艺流程
一般为：
外植体-----细胞的获取-----细胞培养----分离纯化-----产物
1. 外植体的选择与处理
外植体：指从植株取出, 经过预处理后, 用于植物组织和细胞 培养的植物组织(包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子 等) 片段或小块。
2. 植物细胞的获取
直接分离法, 愈伤组织诱导法 原生质体再生法
直接分离法:
植物细胞可以直接从外植体中分离得到。分为机械法和酶 解法两种。
1）机械捣碎法分离植物细胞是先将叶片等外植体轻轻捣碎, 然 后通过过滤和离心分离细胞。
优点: 获得的植物细胞没有经过酶的作用, 不会受到伤害; 不需要经过质壁分离, 有利于进行生理和生化研究。
1. 提高产率 2. 缩短周期
植物细胞生长的倍增时间一般为12～60h, 一般生产周期15～30天。
3. 易于管理, 减轻劳动强度
不受地理环境和气候条件等的影响。
4. 提高产品质量
主要产物的产率较高, 杂质较少； 减少环境中有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀； 产物易于分离纯化。
5. 其他
对剪切力敏感、生产周期长等缺点； 许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。
核苷酸、酶等 多肽药、酶等
三者之间的差异主要有：
•植物细胞>动物细胞>微生物细胞。 •动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 •植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。 •植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的 光照。 •植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 •植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。
二、 植物细胞培养的特点
植物细胞培养技术首先从植物外植体中 选育出植物细胞, 再经过筛选、诱变、原 生质体融合或D N A 重组等技术而获得 优良的植物细胞。然后, 在人工控制条件 的植物细胞反应器中进行植物细胞培养, 从而获得各种所需的产物。
植物细胞培养生产各种天然产物, 与从植物中提 取分离这些物质相比, 具有如下显著特点。
原生质体再生法
原生质体再生法: 原生质体(protoplast) 是除去细胞壁后得到的微球体。
植物原生质体的获得：可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、 器官中获得。
分离方法：机械分离法和酶解法两种, 一般都采用酶解法。
酶解法：植物细胞的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。 为使细胞壁降解释放原生质体, 必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物 质水解的酶制剂, 最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。
缺陷： 由于受到机械的作用, 细胞结构会受到一定的伤害, 获得完整的细胞团或细胞数量少, 其使用不普遍。
2）酶解法分离细胞是利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体, 分 离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层, 而且 还能软化细胞壁。所以用酶解法分离细胞的时候, 必须对 细胞给予渗透压保护, 如甘露醇等。
植物、动物、微生物细胞的特性比较
细胞种类 植物细胞 微生物细胞 动物细胞
细胞大小/um 200～300
1～10
1Biblioteka Baidu～100
倍增时间/h ﹥12
0.3-6
﹥15
营养要求 简单
简单
复杂
光照要求 对剪切力
大多数要求 敏感
不要求 大多数不敏感
不要求 非常敏感
主要产物
色素、药物、 醇、有机酸、氨 疫苗、激素、 香精、酶等 基酸、抗生素、 单克隆抗体、
目前已知的天然化合物超过30 000种, 其中80 % 以上来自于植物; 从植物中得到的最普遍又必不可缺 的药物有17 类, 我国普遍使用的中草药及其制剂80 % 以上来源于植物,美国每年使用的植物来源的药物 超过30 亿美元; 全世界每年使用的植物来源的芳香化 合物的价值超过15 亿美元。
研发历史
愈伤组织诱导法
愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细 胞团。
通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的基本过程:
将选择好含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基加入 0.7 % ～0.8 % 的琼脂, 制成半固体的愈伤组织诱导培养基。 灭菌、冷却后, 将上述外植体植入诱导培养基中, 于25℃左 右培养一段时间, 即从外植体的切口部位长出小细胞团, 此 细胞团称之为愈伤组织。一般培养1～3 周后, 将愈伤组织 分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养, 以获得更多 的愈伤组织。
选择：首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植 株, 如果植物细胞是用于生产次级代谢物, 则需从产生该次 级代谢物的组织部位中切取一部分组织, 经过清洗, 除去表 面的灰尘污物。
操作：将上述外植体切成0. 5～1c m 左右的片段或小块, 用 70 % ～75 % 乙醇溶液或者5 % 次氯酸钠、10 % 漂白 粉、0. 1 % 升汞溶液等进行消毒处理, 再用无菌水充分漂 洗, 以除去残留的消毒剂。
1902 年, 哈勃兰德( Haberlandt) 首次提出分离植物 单细胞并将其培养成植株的设想, 100 年来, 随着培养 基的研制和培养技术的发展, 已经从200 多种植物中 分离出细胞, 不仅可以通过细胞的再分化生成完整的 植株, 而且可以通过细胞培养, 获得400 多种人们所需 的各种物质。