基因工程小论文

绿色荧光蛋白的应用

09化学制药 0932220026 唐骏

2008年的诺贝化学奖由日本科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而共同获得。

绿色荧光蛋白(green f luo rescen t p ro tein,GFP) 是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时, GFP 发射绿色荧光。近年来, 随着GFP 在各种异源细胞, 如细菌、昆虫及植物细胞中的表达, GFP 作为一种新型的报告物在生物学界引起了广泛的关注, 关于它的基本结构、生色团、发光机理及基因的改造均有大量的研究报道。它是一种操作方便, 不用加外源底物, 就能在活细胞中检测的分子探针。将彻底改观过去标记方面的研究方法, 在分子生物学研究中有广阔的应用前景。

关键词：绿色荧光蛋白转基因技术

绿色荧光蛋白的发现与发展

1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了维多利亚多管水母中的发光蛋白—水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班前，他将产物倒进水池里。临出门前关灯，回望了一眼水池，见到水池闪闪发光。因为水池也排放有养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响了光蛋白。然而不久之后，他便确定钙离子能增强光蛋白发光。

绿色荧光蛋白被发现20多年后，才有人将其应用在生物样品标记上。1993年，马丁·沙尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物(如大肠杆菌等）也能产生绿色荧光蛋白，这不仅证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性，还建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基该方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。

1 GFP在转基因研究中的应用特点

目前转基因研究与应用的发展十分迅速，将GFP基因应用到转基因研究中，具有其它基因所无法比拟的以下诸多优点。

1．1 GFP荧光稳定，易于检测

GFP的荧光较稳定，抗光漂白能力比荧光素强，能耐受较长时间的光照。GFP在pH7—12范围内都能正常发光；对高温(70％)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶等都有较强抗性"】。GFP中的发色团是由其一级结构中的一段三肽自然形成，该发色团的形成只需要氧气，不依赖于酶或者其它辅助因子，仅以紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光。用肉眼、荧光显微镜均可以观察到。且灵敏度高，还可进行表达量的半定量或定量检测。

另外，GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光强度，适合在不同物种中专性表达。Tsien卜川发展了颜色迥异的GFP突变体，包括蓝色荧光蛋白BFP(blue fluorescent protein)、青色荧光蛋白CFP(eyan fluorescent protein)和黄色荧光蛋白YFP(yellow fluorescent protein)。随着研究深人，抗酸、抗漂白、亮度高(消光系数与量子产率乘积)、成熟快及单体结构的GFP变体将越来越多，激发和发射光谱范围也将不断拓宽，对该蛋白的检测将越来越容易。

1．2表达调控简单，构建栽体方便

GFP中的发光团由一些常见的非特异氨基酸构建而成，它的翻译后修饰过程不需要原有水母(A．victoria)细胞中任何其它成分或共因子，在细胞内呈自主表达。利用GFP发光时，只需要操纵细胞合成GFP蛋白，元需复杂的翻译后加工过程，GFP就会自动折叠催化并开始发光，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达。由于GFP分子量较小，只含有238个氨基酸，编码GFP的基因序列也较短，约为2．6 kb¨1，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种载体，而不至于使质粒过大而影响转化效率。

2 GFP在转基因研究中的应用进展

2．1 用于筛选转基因成功个体

外源目的基因转入宿主后，能稳定整合的频率低，通常是将携带有目的基因的载体转到若干个宿主中，再从该若干个细胞(或其它)中筛选出成功转化并表达目的基因的个体。因此，如何准确和有效地区分转化与非转化细胞、筛选转化成功的个体是转基因研究中重要的一步。在这一步中，科研工作者通常是在目的基因上游加一个筛选标记基因，利用筛选标记基因在移植前进行阳性筛选，仅把阳性细胞移入受体，则可大大提高转基因动植物的成功率，减少转基因个体筛选鉴定的工作量。目前常采用的筛选标记基因主要有：氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)，葡萄糖苷酶基因(GUS)，荧光素酶基因(Lue)，新霉素磷酸转移酶基因(NPT)，潮霉素磷酸

转移酶基因(HPT)等。利用这些标记基因时，有些需要复杂的样品固定和制备过程、昂贵的底物；有些需要漫长的抗性筛选，对胚胎有一定的毒害作用；大部分还需要特殊的检测手段，给转基因研究工作增加了难度，均不够理想。而将GFP应用于标记基因，可以避免以上缺陷，能够有效、快捷的对转基因个体进行筛选，大大提高了转基因工作效率。黄国存等¨引分别用花粉管通道法和农杆菌介导法将携带有GFP基因的外源基因导入棉花，发现用手持紫外灯结合显微镜检技术能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定，明显比GUS检测方法优越。程在全等¨引用基因枪法将带有绿色荧光蛋白基因的质粒pJPM5和pSBG700分别转入水稻TNG67愈伤组织，在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达，绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多，且不会受自发荧光的太大影响。因此，绿色荧光蛋白基因可以作为水稻(甚至小麦、玉米)转基因研究中的报告基因。李华等¨刮将GFP表达质粒导人BHK、DK、RK等真核细胞，建立真核细胞转基因指示系统，结果表明，GFP 的表达对胚胎无损伤，又经济简便，可避免B一半乳糖苷酶等报告基因的不足，是提高基因转移与筛选效率的理想途径。Vain等第一次对抗生素筛选与GFP筛选进行了直接比较，研究表明GFP能大大提高转化的工作效率，减少了转基因植株分子检测步骤和工作量。

2．2 用于寻找转基因所需的启动子、增强子等调控元件

基因的表达调控研究与转基因研究相辅相成，用转基因方法可研究基因的表达调控，而基因的表达调控研究可更好地指导并应用于转基因研究。启动子、增强子等是基因表达调控的重要元件，也是转基因所需的组件。用不同的启动子与GFP基因相连，构成不同的表达质粒，用于转化合适的细胞，通过观察细胞的荧光强度，就可以比较判断启动子的强弱，找出适合用于转基因的启动子。Clontech公司构建了一种叫启动子报告载体(Promoter reportervector)，即没有启动子的GFP质粒，专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率，以及某些增强子对GFP表达的调控效果。用玉米C4PPDK基因5’端的非翻译片段(5’UTR)与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接，GFP在玉米原生质体中的表达效率比对照质粒(只有35S启动子)提高近15倍，因为5’UTR片段中含转录增强子¨“。将蓝氏贾第虫谷氨酸脱氢酶(GDH)启动子和GFP构成融合基因，转化贾第虫，可以观到绿色荧光，从启动子的5’一末端进行逐步缺失，制备一系列突变体并构成融合基因，转化蓝氏贾第虫，能确定出GDH启动子核心序列。