应用噬菌体抗体库技术制备抗体
噬菌体展示技术和其应用ppt课件
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应用举例：
部分做过的工作
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一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插 入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗 体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链 质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
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M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
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34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR： 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60％左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展
噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展王志文【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2015(040)001【总页数】3页(P131-133)【关键词】噬菌体;噬菌体抗体库;小分子抗体;免疫抗体库;综述【作者】王志文【作者单位】蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室,安徽蚌埠233030【正文语种】中文【中图分类】R373.9噬菌体抗体库技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术。
通过噬菌体表面表达技术，将抗体分子Fab段基因或Fv基因通过与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ基因连接以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，从而形成噬菌体抗体。
继1988年Parmley等［1］首次阐明噬菌体表面表达技术以来，抗体分子是噬菌体表面表达的第一个具有天然蛋白质功能的蛋白质分子。
Hoogenboom等［2］将轻链基因插入噬菌体载体的左臂，重链基因插入噬菌体载体的右臂，连接后包装成噬菌体，建立了第一个噬菌体抗体文库。
随着噬菌体载体系统的改进，噬菌体抗体技术得到广泛的应用，为了提高抗体库的多样性，在CDR区随机引入核苷酸序列而构成人工合成噬菌体抗体库;在已获得的阳性克隆的基础上，在特异性抗体基因CDR区进行基因突变筛选［3］，以获得高亲和力的特异性抗体。
噬菌体表面展示技术的问世和噬菌体抗体表达筛选系统的逐渐完善，使人们可以完全跨越抗原免疫而直接获得丰富多样的特异性抗体。
本文就噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展作一综述。
1 噬菌体抗体库技术噬菌体属DNA单链病毒，长约7 000 bp。
噬菌体在细菌内滚环复制，被噬菌体感染的细菌不会裂解，但生长速度减慢，同时分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。
噬菌体基因组共编码11种蛋白，噬菌体展示技术通常选择在信号序列和p蛋白第一结构域之间插入外源蛋白编码序列，经过噬菌体的包装加工，外源蛋白即可表达在病毒颗粒的表面［4］。
Ward等［5］采用PCR技术从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA中扩增出VH基因，测序证实了其多样性，并随后在大肠埃希菌中表达了该VH片段。
抗体制备技术的发展和医学应用
抗体制备技术的发展及其医学应用抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。
它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。
国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。
抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。
多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。
因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1 抗体的发展抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。
1.1 免疫血清学研究阶段免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。
噬菌体抗体库技术及其应用研究进展
综述doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．04．031噬菌体抗体库技术及其应用研究进展潘博1，2，童贻刚11．军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京100071；2．东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030［摘要］噬菌体呈现抗体库是近年发展的一项分子生物学新技术，它的建立是抗体技术领域中的一次革命性进展。
它以其独特的构建和筛选系统，彻底改变了抗体制备的传统途径，使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段，并对生物学领域中许多技术的发展起到了巨大的推动作用。
该技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的制备抗体技术。
我们简要综述此项技术的研究应用进展。
［关键词］噬菌体抗体库；抗体人源化；抗体工程技术［中图分类号］R392．1［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)04－0581－05Phage Antibody Library Technology and its ApplicationPAN Bo1,2,TONG Yi－Gang11．State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071;2．College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Haerbin150030;China［Abstract］Phage－displayed antibody library is a new thchnique which has been developed very rapidly and leads to revolution in the area of antibody engineering in recent years．This technology employes an unique system of antibody construction and screening,and changes the classical method of antibody preparation completely．It pro-motes antibody engineering,into a new developing stage and improves many other technologies in biological fields．So far phage antibody library is the most developed and widely applied technique in the field of antibody prepara-tion．In this review,we focused on the progress of this technique．［Key words］phage antibody library;antibody humanization;antibody engineers and technicians抗体是机体防御系统的重要分子，用于识别和清除外来入侵物。
噬菌体抗体库技术在抗体研发中的运用
噬菌体抗体库技术在抗体研发中的运用蒋红欣【摘要】噬菌体抗体库技术是一种以噬菌体为载体,将外源抗体库基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中,并组装出具有扩增能力且在噬菌体表面无缺损表达抗体的融合噬菌体的技术.噬菌体抗体库技术已广泛运用于单克隆抗体的研发,它相对于传统的筛选技术,在时间周期,抗体类型,筛选范围,经济成本等有较为突出的优势.本文主要介绍噬菌体抗体库技术的原理、类型、运用以及最新研究进展.【期刊名称】《黑龙江科技信息》【年(卷),期】2017(000)033【总页数】2页(P158-159)【关键词】噬菌体抗体库技术;抗体筛选;抗体库【作者】蒋红欣【作者单位】上海交通大学生命科学院,上海 200240【正文语种】中文近几年，生物制药产品在全球市场上的占比明显上升，单克隆抗体药物是近年来医药研发领域的热点，也将是未来生物制药行业发展的重要动力所在。
从1986年[1]，美国FDA批准了第一个单克隆抗体药物上市，到2015年抗体药物的全球销售额已经超过了906亿美金，并且每年不断增长。
截至2017年5月1日[2]，已有74个抗体或抗体类似物被FDA或EMA批准上市。
此外，有70个抗体或抗体类似物在临床III期，575个抗体类似物在临床I/II期进行实验。
在这719个分子中有493个抗体IgGs形式，87个抗体偶联物，61双特异性抗体，37个FC融合蛋白，17个免疫球蛋白，13个抗体片段和11个免疫细胞因子。
每年，有更多的抗体被发现并运用于疾病的治疗中。
抗体药物的发展历经了多次进化[3]：从最初的的为鼠源抗体[4]，二代人鼠嵌合抗体；三代为人源化抗体，四代为全人源抗体。
全人抗体[5]是基于噬菌体抗体文库的技术手段而得到的抗体，它通过抗原筛选库中相应的抗体片段，再经体外加工可形成有功能的完全人抗体。
阿达木单抗（Adalimumab）[2]是第一个从噬菌体展示技术得到的全人单克隆抗体，它特异性结合人肿瘤坏死因子(TNF)，阻断TNF 和受体的结合从而产生生物学效果。
噬菌体抗体库的构建与初步鉴定
噬菌体抗体库的构建与初步鉴定目的运用噬菌体展示技术构建抗人β淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，分离纯化mRNA，经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段，再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起，克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，转化至大肠杆菌TG1，经辅助噬菌体M13KO7超感染后回收全部重组噬菌体，构建噬菌体抗体库，SDSPAGE鉴定纯度.结果经琼脂糖凝胶电泳分析，RTPCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325bp，与预期VH，VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体，回收后构建成库容量为1.1108的噬菌体抗体库，经SDSPAGE鉴定，得到Mr约为30000ku，纯度较好的ScFv抗体.结论成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库，为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.噬菌体展示技术;单链抗体;阿尔茨海默病;β淀粉样肽0引言阿尔茨海默病(alzheimersdisease,AD)，又称早老性痴呆症，是一种以记忆丧失、行为失常、人格改变、思维能力下降和认知功能障碍等为特征的中枢神经系统退行性疾病.有研究报道β淀粉样肽(βamyloidpeptide,Aβ)与AD的发病直接相关[1-2].目前国内仅有制备Aβ42多克隆抗体的相关工作，有关建立良好的血液标志物检测方法的研究报道还较少见.本实验通过噬菌体抗体库技术[3-4]构建抗Aβ的单链抗体库，为检测血液或脑脊液中Aβ水平并用于诊断AD[5-6]和抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定以及临床治疗应用打下基础.1材料和方法1.1材料雌性BALB/c纯系小鼠20只，6～7wk龄(中山大学实验动物中心);cDNA第一链合成回收试剂盒(美国Fermentas公司);鼠ScFv噬菌体抗体展示系统(瑞典Amershampharmacia公司);Trizol试剂(美国Gibco公司);DNA 多聚酶，QIAquickPCR纯化试剂盒(荷兰Qiagen公司);SfiI内切酶，NotI内切酶(美国NEB公司);T4DNALigase(美国Invitrogen公司);Aβ(美国Americanpeptide公司).1.2方法1.2.1动物免疫将0.5mL的Aβ42(150mg/L)与等量的完全福氏佐剂混合乳化，直到油包水的状态，取5只小鼠用Aβ42进行免疫.第一次基础免疫每只小鼠自后足垫注射0.1mL.基础免疫后2wk再按上述方法用等量的抗原与不完全福氏佐剂乳化后进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射0.1mL，共加强免疫2次.45d后引颈法处死免疫小鼠，取其脾脏.1.2.2总RNA抽提与mRNA的纯化用TRIzol试剂抽提小鼠脾细胞的总RNA，并立即纯化mRNA，紫外分光光度计测定其浓度及纯度.1.2.3cDNA第一链的合成取两个灭菌的0.5mL的离心管，在每一管中依次加入mRNA2μL，Oligo(dT)18引物1μL，去RNase水9μL，混匀，置于70℃水浴5min，立即置于冰中，在冰上再加入5倍稀释缓冲液4μL，核糖核酸酶抑制剂1μL，dNTP(10mmol/L)mix2μL，混匀，室温静置5min后再加入MMuLV逆转录酶(2108U/L)1μL，总反应体积为20μL.42℃水浴60min，70℃水浴10min灭活，立即置于冰中5min，完成cDNA第一链的合成.1.2.4PCR扩增抗体的重链和轻链可变区片段取两个灭菌的0.5mL的离心管，在轻链PCR扩增管中分别依次加入cDNA 模板20μL，轻链引物2μL，dNTP(10mmol/L)5μL，10倍稀释缓冲液10μL，DNA聚合酶1μL，ddH2O62μL.重链PCR管cDNA模板20μL，重链引物1∶2μL，重链引物2∶2μL，dNTP(10mmol/L)5μL，10倍稀释缓冲液10μL，DNA聚合酶1μL，ddH2O60μL.95℃热启动5min后，进行如下循环94℃30s，53℃45s，72℃60s，共30个循环，最后一个循环结束后，72℃延伸10min，然后取5μLPCR产物琼脂糖凝胶电泳，同时加DNA分子量标准，用紫外分析仪检测电泳结果，鉴定PCR产物片段大小.1.2.5重链和轻链可变区片段与Linker的连接扩增出的抗体重链(VH)和轻链(VL)的PCR产物按Qiagen公司的QIAquickPCR纯化试剂盒中的说明书进行回收纯化.用琼脂糖凝胶电泳，纯化后的VH和VL与标准浓度的VHmarker分别按1∶1和1∶2稀释后上样电泳进行比较定量，根据条带的亮度来估计基因片段的含量.以相同和接近等摩尔浓度的抗体VH和VL基因混合进行重组PCR反应，按Pharmacia公司的重组噬菌体抗体库系统(RPAS)操作手册进行与Linker的连接PCR反应.然后在PCR产物加上酶切位点后，取5μLPCR产物用15g/L的琼脂糖凝胶电泳，同时加DNA分子量标准，用紫外分析仪检测电泳结果，鉴定PCR反应产物片段的大小.1.2.6连接片段的克隆取一灭菌的0.5mL的离心管，在每一管中依次加入纯化的PCR产物17μL，SfiI1μL，10倍稀释缓冲液2μL，50℃温育2h，酶切产物胶回收纯化.另取一灭菌的0.5mL的离心管，在每一管中依次加入SfiI酶切后的ScFv片段40μL，NotI1μL，BAS0.5μL，10倍稀释缓冲液5μL，ddH2O4.5μL，37℃温育3h，酶切产物胶回收纯化.1.2.7质粒的转化与筛选取4个灭菌0.5mL的离心管，在每一管中依次加入纯化的酶切后ScFv40μL，pCANTAB5E质粒5μL，ATP(10mmol/L)5μL，T4DNA连接酶1μL，5倍稀释缓冲液6μL，ddH2O3μL，24℃温育1h，每个连接产物分别进行回收纯化.1.2.8感受态细菌的制备用划线法将大肠杆菌TG1接种于基本培养基平皿上，于37℃倒置培养过夜，再用无菌牙签挑取一个单菌落至5mL的培养液中，37℃振荡(250r/min)过夜培养.次日取菌液1mL接种至含有100mL培养液的500mL烧瓶中，37℃振荡培养至吸光度(A600nm)达到0.4～0.5时(约需2～3h)，4℃，2500r/min离心15min，弃上清液，再加10mL 预冷的TSS重悬菌体，完成制备感受态大肠杆菌，2～3h内进行转化.1.2.9质粒的转化将4种纯化连接产物分别按以下方法进行转化，转化后收集的噬菌体抗体合并到一起组成噬菌体抗体库.在无菌状态下分别取1mL新鲜感受态大肠杆菌TG1至两个预冷的50mL离心管中，置于冰中.其中一个加入50μL纯化的连接产物，另一个加入500pg未经酶切的pUC18质粒，轻轻旋转以混合内容物.冰浴45min.将试管置于42℃水浴2min使细胞热休克，然后立即置于冰中，转化后，用质粒pUC18来检查其转化效率.取100μL转化后至含有900μL的LBG(含20mol/L葡萄糖的LB培养液)的试管中，37℃振荡(250r/min)培养1h，分别取100，10，1μL的培养物在SOBAG琼脂板(含100mg/L氨苄青霉素和2g/L葡萄糖的SOB培养基)上铺盘，同样方法另取100μL未进行转化的感受态大肠杆菌TG1在SOBAG平板上铺盘作为对照组.37℃倒置培养过夜，次日计算菌落数.1.2.10噬菌体抗体库的扩增取900μL转化的大肠杆菌至一无菌的50mL试管中，加入9.1mL含10g/L葡萄糖培养液，37℃振荡(250r/min)培养1h后，再加50μL的20g/L氨苄青霉素和的M13KO7辅助噬菌体，37℃振荡(250r/min)培养1h，1000g离心10min，弃去上清，用10mL的不含葡萄糖的培养液重悬，37℃振荡(250r/min)培养过夜.1000g离心20min，将含有重组噬菌体的上清液转入一无菌的50mL离心管中，0.45μm 过滤后分装保存于2℃～8℃备用，此浓缩后的噬菌体抗体库可用于富集筛选、纯化和鉴定.1.2.11ScFv基因噬菌体抗体库表达抗体的初步鉴定纯化后的单链抗体用SDSPAGE电泳鉴定其纯度，同时设分子量标准电泳，考马斯亮蓝R250染色.2结果2.1总RNA的提取及mRNA的纯化从Aβ免疫后小鼠脾细胞中抽提总RNA，经紫外分光光度计测得总RNA浓度为5.16g/L，纯化后的mRNA的A260nm/A280nm为1.90，浓度为1.28g/L.2.2抗体VL和VH基因的扩增结果显示，VH基因片段约为350bp，VL基因片段约为325bp，与预期VH，VL基因片段理论值大小相符(图1).M1:VHmarker;M2:DNAmarker;1:VHPCR产物;2:VLPCR产物.图1VH和VL基因片段的琼脂糖凝胶电泳分析(略)2.3ScFv基因的连接结果如图2所示，可见约750bpPCR 扩增产物，大小符合预期结果，没有明显的非特异性条带，表明加入VH，VL和Linker引物的浓度准确，并引入了用于在噬菌粒载体pCANTAB5E中进行克隆的限制性内切酶SfiI和NotI 位点.M1:ScFvmarker;M2:DNAmarker;S:ScFvPCR产物.图2ScFv基因片段的琼脂糖凝胶电泳分析(略)2.4抗体ScFv基因的克隆及噬菌体抗体库的构建酶切后抗体ScFv基因片段经琼脂糖凝胶与标准浓度的ScFvmarker比较，ScFv的浓度约20mg/L.在连接反应中，插入的ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB5E的量为3∶1效果最理想.ScFv 基因片段通过连接反应成功定向克隆至pCANTAB5E噬菌粒载体的SfiI和NotI位点中.噬菌体载体成功转化至大肠杆菌TG1，经过两次培养，收集所有重组噬菌体，成功构建的噬菌体抗体库，合并计算，噬菌体抗体库的库容量达1.1108.2.5抗体ScFv基因的噬菌体抗体库表达抗体的初步鉴定浓缩提取的ScFv，经蛋白质L琼脂糖亲和纯化得到Mr约为30ku，紫外分光光度计检测结果显示，纯化后单链抗体的表达量约为1.1mg/L，还原性SDSPAGE结果显示纯度较好的ScFv(图3).1:浓缩上清培养液;M:marker;2:纯化ScFv.图3纯化ScFv的SDSPAGE(略)3讨论目前已知Aβ蛋白在人类大脑中的沉积和神经纤维缠结的产生是AD的主要组织病理学标志[2]，并揭示了细胞内Aβ在大脑内沉积的现象以及Aβ具有毒性的作用机制[7-8].由于临床对AD诊断较为困难，尤其是发病早期，采用血标本进行检测的方法还没有完全建立起来.因此建立新的临床试验诊断方法，尤其是检测血液中的标记物，并且能够区分AD和正常衰老以及其它痴呆的试验方法已成为热点.噬菌体抗体库技术的建立是基因工程抗体研究领域的一次重大突破，使传统的mAb的制备完全改观，为重组抗体的设计、筛选及生产等方面的不断革新及改进提供了高效、可靠的技术和方法，极大地推动了重组抗体在科研、临床诊断及治疗等方面的应用[10-11].此方法简单、快速，而杂交瘤技术从脾细胞融合到获得稳定的单克隆细胞株至少需数月[12].噬菌体抗体库技术可以绕过运用杂交瘤细胞免疫制备抗体，在大肠杆菌中分泌表达，通过发酵大量生产，具有大规模生产、成本低等特点，克服了杂交瘤细胞通过mAb腹水或大规模细胞培养制备抗体的局限性，同时能够保存和传代稳定性，避免了杂交瘤细胞株在传代过程中明显的不稳定性，我们的研究结果显示，直接利用人外周血淋巴细胞构建天然抗体库，筛选出目的噬菌体抗体，使制备全人抗体，尤其是制备自身抗原和其他弱免疫原性抗原的抗体具有独到的优势[13]，并可以对抗体基因进行改造.在体外通过基因突变、链更替等技术，进一步提高抗体的亲和力和稳定性.用于制备mAb，并对抗体库进行筛库时，能够得到多克隆重组噬菌体抗体，将该多克隆抗体用于临床试验诊断可提高敏感度，用于治疗可提高疗效，也可以作为分子识别、抗原表位研究的理想工具.综上所述，本实验利用基因工程方法和噬菌体表面展示技术成功构建了免疫小鼠库容量为1.11 08的噬菌体抗体库，为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立以及治疗应用打下基础.。
全人源抗体技术浅谈：噬菌体抗体文库技术
全人源抗体技术浅谈：噬菌体抗体文库技术单克隆抗体是治疗性蛋白质中数量最大且发展最快的一组。
目前已有70多种抗体药物获得临床用药上市批准，2017年抗体药物的市场规模突破了千亿美元。
目前有500多种治疗性抗体及其衍生物正在临床试验中，重点放在癌症治疗和自身免疫性疾病上。
第一个被批准的治疗性抗体是通过小鼠杂交瘤技术获得的。
然而，鼠抗体因其对人体来说具有具有异源性，因此引起患者强烈的人抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA）免疫反应。
解决这个问题的一个方法是重组DNA技术。
使用基因工程技术，将人抗体的序列交换鼠的部分序列，得到“嵌合的”（人抗体恒定区取代的鼠抗体恒定区）或“人源化”的抗体（仅鼠抗原结合区/互补决定区CDR被转移到人可变区框架中）。
这些工程化的抗体在治疗性抗体批准的第一个十年中占主导地位，创造了辉煌战绩。
但即使是人源化程度非常高的人源化抗体，其中依然至少含有1% ~ 5%的异源成分。
随着人们在全人源化抗体技术方面的进步，全人源抗体正后来居上，占据了新抗体药物研发的主导地位。
全人源抗体研究始于20世纪90年代，发展到今天，目前已形成了抗体库技术、转基因动物或转染色体动物这三种制备全人源抗体的代表性技术。
转基因动物，通常是小鼠或大鼠，通过实验手段导入人免疫球蛋白基因座，而他们自己的抗体基因被敲除。
因此，在免疫之后，他们利用这个序列库从人类种系序列中产生IgG，由此可以通过经典的杂交瘤技术产生单克隆抗体。
抗体库技术，例如代表性的噬菌体抗体展示技术，无需免疫，可以在体外产生全人源人抗体。
噬菌体抗体库技术制备全人源抗体通常先分离免疫或未被免疫的B 细胞，并采用RT-PCR技术扩增其中全部的抗体VH、VL基因片段；将体外扩增的VH、VL基因片段随机克隆入相应载体，构建成为Fab 或ScFv等形式的抗体组合文库；再将抗体基因组合文库插入噬菌体编码的膜蛋白的基因III(g3)或基因VIII(g8)的先导系列的紧邻下游，使外源抗体基因表达的多肽可以以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白pIII或pVIII的N端。
噬菌体抗体库构建技术在疾病防治中的应用
噬菌体抗体库构建技术在疾病防治中的应用张聪敏;霍萍萍;赵宝华【摘要】噬菌体抗体库技术(phage antibody library)是近年发展的一项分子生物学新技术,近年来越来越多的学者利用这项技术获得目标抗体以应用于医疗制药及安全检测等多个领域.噬菌体抗体库技术的发展和应用,为抗体技术领域带来了巨大的变化,极大地推动了各种性能优良基因工程抗体的开发和应用.针对噬菌体抗体库构建的原理、方法、构建过程中所需考虑的因素以及在不同领域的应用作了综述.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)010【总页数】6页(P84-89)【关键词】噬菌体抗体库;文库多样性;疾病防治【作者】张聪敏;霍萍萍;赵宝华【作者单位】河北师范大学生命科学学院,石家庄050016;河北师范大学生命科学学院,石家庄050016;河北师范大学生命科学学院,石家庄050016【正文语种】中文近年来，随着分子免疫学和抗体工程技术的发展，抗体工程进入了基因工程抗体的年代，自1984年第一个人－鼠嵌合基因工程抗体问世以来，新型抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体、多价小分子抗体及抗体融合蛋白等。
各种基因工程抗体的成功制备和应用将抗体药物的研制带进了一个快速发展的新时期[1] 。
目前，基因工程抗体的制备和筛选最突出的研究进展就是噬菌体抗体库技术，通过该技术既可以大量制备抗体，又可改良抗体特性，如获得多种高亲和力的特异性抗体等，为基因工程抗体研究开辟了新途径，已在许多领域得到了广泛应用。
噬菌体抗体库是近年来出现的噬菌体展示(phage display)技术基础上发展起来的，依赖于3项试验技术：PCR技术的发展;从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功;噬菌体表面表达技术的建立[2] 。
其原理是以丝状噬菌体(M13、Fd)为背景载体，将抗体的全套可变区基因克隆出来，组装到噬菌体中，使其与编码外壳蛋白的基因Ⅲ或基因Ⅷ相连，经大肠杆菌表达，抗体基因被包装在噬菌体内部，抗体蛋白表达噬菌体颗粒的表面，就得到了噬菌体抗体库，再通过“吸附－洗脱－扩增”，就可从中筛选出特异性抗体。
应用噬菌体抗体库技术制备抗体
应用噬菌体抗体库技术制备抗体摘要：噬茵体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(scFv)与噬茼体外壳蛋白基因PⅢ或PVI]I连接，使融合蛋白表达于噬茵体颗粒的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程富集筛选特异性抗体.。
这一技术将抗体基因型和表型联系在一起，使识剐抗原的能力和噬茵体的可扩增性统一起来，较好的模拟了体内的抗体产生的过程，成为一种高效的筛选体系。
噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。
构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础.本文就噬茵体抗体库技术的原理、构建、筛选做一综述。
关键词：噬茵体抗体库技术；抗体库；噬茵体噬菌体抗体库技术(phage display antibody li—brary techniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体。
20世纪80年代中期，Smith 在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。
由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线.1 噬菌体抗体库技术的基本原理噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体的外壳蛋白Ill(PIl1)或外壳蛋白Ⅷ(PⅧ)基因随机重组，继而感染大肠杆菌，经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv一外壳蛋白融合蛋白的形式表达。
这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。
所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。
噬菌体抗体库技术(1)
噬菌体抗体库技术张爱华 余模松 【摘要】 噬菌体抗体库技术是20世纪90年代继噬菌体展示技术发展而来。
这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。
噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。
本文对与基因工程抗体相关的噬菌体展示技术以及噬菌体抗体库技术作一综述。
【关键词】 噬菌体展示技术;噬菌体抗体库技术;免疫抗体库 【中图分类号】R 392.11 【文献标识码】A 【文章编号】1673-4211(2006)01-0013-04 作者单位:430060武汉生物制品研究所免疫学研究室 20世纪80年代,随着DNA 重组技术的进展和抗体基因结构的阐明,产生了基因工程抗体技术。
早期用于构建基因工程抗体的抗体基因主要来源于小鼠杂交瘤细胞。
由于要获得杂交瘤细胞必须经过动物免疫、细胞融合及克隆筛选这样一个长期、复杂的过程;而且利用杂交瘤技术很难制备人源抗体和抗自身抗原或弱免疫原性抗原的抗体,所以限制了基因工程抗体技术的推广和应用。
20世纪90年代,人们又将噬菌体展示技术应用到抗体的表达和克隆,将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因文库和抗体在大肠杆菌功能性表达与高效快速的筛选手段结合起来,产生了噬菌体抗体库技术,这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,由此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。
噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术[1]。
1 噬菌体展示技术 1985年Smith [2]首次阐述了噬菌体展示技术,该技术通过将外源蛋白或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该外源分子呈现于噬菌体表面。
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内,即在噬菌体表面表达特定蛋白,而在噬菌体核心DNA 中含有该蛋白的结构基因,通过表型筛选就可以获得其编码基因,因此噬菌体展示技术是一种强有力的基因表达筛选技术。
噬菌体抗体库技术的基本方法
②HBeAg放射性核素标记抗体 诊断试剂
③HAV抗原放射性核素标记抗体 诊断试剂
④AFP放射性核素标记抗体 诊断试剂
⑤CEA放射性核素标记抗体 诊断试剂
三、导向诊断药物
放射性核素标记抗体 肿瘤放射免疫显像 放射免疫显像优点： ①在体内确切肿瘤定位作用，准确性 达90%，灵敏度达100%。 ②在体内可检出0.5cm大小的病灶，并 可检出肺脑的转移灶。
认为P蛋白是ATP酶依赖性药泵，药物 进入细胞后与P蛋白结合，利用ATP水 解释放的能量将药物泵出胞外，使胞 内药物蓄积减少，因而产生耐药性。
三、毒素偶联的抗体药物
⒈免疫毒素及其换代制品
在导向药物中，毒素和抗体的交联物 称为免疫毒素。
第一代免疫毒素是包含有A、B链完整 毒素和抗体的交联物，其中B链非特异 性结合，使其仅在体外应用。
一、血清学鉴定用的抗体类试剂 ⒈鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴常用诊断血清的品种和用途
①沙门氏菌属诊断血清 ②志贺氏菌属诊断血清 ③病原性大肠埃希氏菌诊断血清
⑵诊断血清的制备步骤 ①制备细菌抗原 ②免疫动物和制备抗体血清
⑶诊断血清诊断方法
⒉乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂
⒊妊娠诊断试剂 ⒋抗ABO血型系统血清
第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片 段与毒素的A链或与A链相似的单链核 糖体失活蛋白的结合物。因避免了第 一代免疫毒素的非特异性，故能在体 内有一定的抗肿瘤作用。
第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因 克隆方法改造毒素基因和小分子抗体 基因重组表达。特异性好、稳定性强、 渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。
二、抗癌药物偶联的抗体药物
⒈常用的抗癌药物
噬菌体抗体库技术
马 小 兵 １， ２＊ ＊ 畅 继 武 ２
（ １ 华 北 煤 炭 医 学 院 病 理 教 研 室 天 津 ２ 天 津 医 科 大 学 天 津 市 泌 尿 外 科 研 究 所 天 津 ３００２１１ ）
摘 要 噬 菌 体 抗 体 库 技 术 是 指 从 人 外 周 血 、脾 或 骨 髓 淋 巴 细 胞 提 取 总 Ｒ ＮＡ， 利 用 逆 转 录－ 多 聚 酶 链 反 应 （ Ｒ Ｔ － ＰＣＲ ） 方 法 扩 增 抗 体 的 全 套 可 变 区 基 因 ， 通 过 噬 菌 体 表 面 展 示 技 术 ， 把 抗 体 Ｆａｂ 段 或 单 链 抗 体 表 达 在 噬 菌 体 表 面 ， 构 建 人 源 抗 体 库 。 噬 菌 体 抗 体 将 基 因 型 （ ｇｅｎｏｔｙｐｅ） 和 表 型 （ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ） 统 一 于 一体， 将选择能力和扩增能力偶联起来， 具有强大的筛选能力， 能够在体外模拟体内的抗体生成过程， 使抗体工程技术进入了一个新的时代。
噬菌体抗体库技术的产生取决于 ３ 项实验技术 的 发 展 ： １） ＰＣＲ 技 术 的 发 展 使 人 们 可 以 用 一 组 引 物 （ 免疫球蛋白可变区中骨架部分的保守序列）， 通过 ＲＴ－ ＰＣＲ 直 接 从 总 ＲＮＡ 克 隆 出 全 套 免 疫 球 蛋 白 可 变 区 基 因 。２） 大 肠 杆 菌 可 以 将 有 抗 体 活 性 的 免 疫 球 蛋 白 分 子 片 段 分 泌 入 周 质 腔 （ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ） 。３） 噬 菌体展示技术的建立， 即将抗体基因插入到丝状噬菌 体衣壳蛋白基因中， 使抗体基因对应的表达产物融合 在噬菌体衣壳蛋白中形成融合蛋白， 呈现在噬菌体表 面 ， 形 成 含 有 全 套 抗 体 谱 （ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ） 的 噬 菌 体 抗 体 库 ， 进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体， 是噬 菌体抗体库技术的核心。 ２ 丝状噬菌体（ｆｉｌａ ｍｅ ｎｔｏｕｓ ｐｈａ ｇｅ ）的生物学特征
噬菌体展示技术的原理及应用
二、噬菌体展示技术旳应用现状
抗体： 抗狂犬病毒旳单链抗体， 抗HIV-1囊膜糖蛋白旳单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并体现有gp120旳淋巴细胞, 中和响尾蛇毒素旳单链抗， 等等。
疫苗： 展示在噬菌体表面旳HIV-1 旳gp120-V3 环 可象天然抗原一样引起明显旳免疫应答, 等等。
噬菌体抗体库旳构建
Antibody IgG structure
Antibody IgG structure
C
L
V
L
V
H
C
H
1
V
L
C
L
V
H
C
H
1
C
H
2
C
H
2
C
H
3
C
H
3
Antibody IgG structure
Hinge
(Fab’)2
Fab
Fc
MembraneExtension
Antibody IgG structure
选择措施： 淘选（Panning)而不是 筛选（Screening)
非展示系统 展示系统
Solid phase selection with immunotubes
B
B
B
B
B
B
Immunotubecoated withantigen
诊疗 被动免疫 抗体 蛋白质构造分析 药物导航 蛋白质纯化
Wash to remove unbound phage particles.
Elute bound phage
Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
噬菌体抗体库技术及其应用_吴懿娜
[9]Wo l f M ,A l b r e c h t S ,M är k i C ,e t a l .P r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g o f c h e m o -k i n e s :i m p l i c a t i o n si np h y s i o l o g i c a l a n dp a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s [J ].I n t J B i o c h e m C e l l B i o l ,2008,40(6-7):1185-1198.[10]M c Q u i b b a nG A ,G o n g J H ,T a mE M ,e t a l .I n f l a m m a t i o n d a m p e n e db y g e l a t i n a s e Ac l e a v a g e o f m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n -3[J ].S c i e n c e ,2000,289(5482):1202-1206.[11]We b e r M ,B l a i r E ,S i m p s o nC V ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o r D 6c o n s t i t u t i v e l yt r a f f i c s t o a n df r o m t h ec e l l s u r f a c et oi n t e r n a l i z ea nd de g r a d e c h e m o k i n e s [J ].M o l B i o l C e l l ,2004,15(5):2492-2508.[12]G r a h a m G J .D 6a n dt h ea t y p i c a l c h e m o k i n er e c e p t o r f a m i l y :n o v e lr e g u l a t o r s o f i m m u n ea n di n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s [J ].E u r J I m m u -n o l ,2009,39(2):342-351.[13]B o n e c c h i R ,B o r r o n i E M,A n s e l m o A ,e t a l .R e g u l a t i o no f D 6c h e -m o k i n e s c a v e n g i n g [J ].B l o o d ,2008,112(3):493-503.[14]G r a h a mG J ,M c K i m m i e C S .C h e m o k i n e s c a v e n g i n g b y D 6:am o v a -b l e f e a s t ?[J ].T r e n d s I m m u n o l ,2006,27(8):381-386.[15]M a r t i n e z d e l a T o r r e Y ,L o c a t i M ,B u r a c c h i C ,e t a l .I n c r e a s e di n -f l a m m a t i o ni nm i c ed e f i c i e n t f o rt h ec h e m o k i n ed e c o yr e c e p t o r D 6[J ].E u r J I m m u n o l ,2005,35(5):1342-1346.[16]J a m i e s o nT ,C o o k D N ,N i b b s R J ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o r D 6l i m i t s t h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i nv i v o [J ].N a t I m m u n o l ,2005,6(4):403-411.[17]Wh i t e h e a d G S ,Wa n g T ,D e G r a f f L M ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o rD 6h a s o p p o s i n g e f f e c t s o na l l e r g i c i n f l a m m a t i o na n d a i r w a y r e a c t i v i t y [J ].A mJ R e s p i r C r i t C a r e M e d ,2007,175(3):243-249.[18]L i uL ,G r a h a mG J ,D a m o d a r a nA ,e t a l .C u t t i n ge d g e :T h es i l e n tc h e m o k i n e r e c e p t o r D 6i s r e q u i r ed f o r ge n e r a t i n g Tc e l l r e s p o n s e s t h a t m e d i a t e e x p e r i m e n t a l a u t o i m m u n e e n c e p h a l o m y e l i t i s [J ].J I m m u n o l ,2006,177(1):17-21.[19]D 'A m i c oG ,F r a s c a r o l i G ,B i a n c h i G ,e t a l .U n c o u p l i n go f i n f l a m -m a t o r y c h e m o k i n e r e c e p t o r s b y I L -10:g e n e r a t i o n o f f u n c t i o n a l d e c o y s [J ].N a t I m m u n o l ,2000,1(5):387-391.[20]A r i e l A ,F r e d m a nG ,S u nY P ,e t a l .A p o p t o t i cn e u t r o p h i l sa n dTc e l l ss e q u e s t e r c h e m o k i n e sd u r i n g i m m u ne r e s p o n s e r e s o l u t i o n t h r o u g h m o d u l a t i o nof C C R 5e x p r e s s i o n [J ].N a t I m m u n o l ,2006,7(11):1209-1216.文章编号:1007-8738(2010)04-0404-03噬菌体抗体库技术及其应用吴懿娜,杜欣军,张伟伟,董 峰,王 硕＊(天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全省部共建教育部重点实验室,天津300457)收稿日期:2009-11-23; 接受日期:2010-01-05基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2006A A 10Z 448);国家自然科学基金资助项目(20905058)作者简介:吴懿娜(1985-),女,天津人,硕士E -m a i l :y n w u 517@y a h o o .c o m .c n[关键词]噬菌体展示;抗体库;小分子物质[中图分类号]Q 789 [文献标识码]A 目前,抗体在在临床医学研究和食品环境安全检测等方面应用广泛,随着分子生物学的不断发展,利用基因工程手段获得基因工程抗体的方法成为抗体技术研究的热点,自从S m i t h 于1985年第一次成功地将E c o R Ⅰ核酸内切酶基因插入丝状噬菌体基因p Ⅲ中,并在噬菌体表面表达出了融合的蛋白,及1990年M c C a f f e r t y 等又在此基础上构建了库容为106的抗体库,并从中成功地筛选出了溶菌酶单链抗体后,噬菌体抗体库技术成为了抗体工程中的一种新兴的抗体制备的手段。
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湖南农业大学课程论文
学院：生物科学技术学院班级：08C生工
姓名：李栋学号：200842145118 课程论文题目：应用噬菌体抗体库技术制备抗体
课程名称：
评阅成绩：
评阅意见：
成绩评定教师签名：
日期：年月日
应用噬菌体抗体库技术制备抗体
李栋
生物科学技术学院08C生工200842145118
摘要：噬茵体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(scFv)与噬茼体外壳蛋白基因PⅢ或PVI]I连接，使融合蛋白表达于噬茵体颗粒的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程富集筛选特异性抗体.。
这一技术将抗体基因型和表型联系在一起，使识剐抗原的能力和噬茵体的可扩增性统一起来，较好的模拟了体内的抗体产生的过程，成为一种高效的筛选体系。
噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。
构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础.本文就噬茵体抗体库技术的原理、构建、筛选做一综述。
关键词：噬茵体抗体库技术；抗体库；噬茵体
噬菌体抗体库技术(phage display antibody li—brary techniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体。
20世纪80年代中期，Smith 在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。
由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线.
1 噬菌体抗体库技术的基本原理
噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体的外壳蛋白Ill(PIl1)或外壳蛋白Ⅷ(PⅧ)基因随机重组，继而感染大肠杆菌，经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv一外壳蛋白融合蛋白的形式表达。
这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。
所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。
它的最大特点是实现了直接将基因型
和表型联系在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性抗体。
2 噬菌体抗体库的构建
噬菌体抗体库按抗体基因的性质分为DNA文库和cDNA 文库，按抗体基因的来源分天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库等。
免疫球蛋白基因可来源于杂交瘤细胞、体外免疫的细胞、致敏及非致敏的B淋巴细胞(骨髓、外周血、病灶局部引流淋巴结、扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等)，其中以淋巴结的B淋巴细胞较好。
建库的大致过程是：首先提取细胞的总RNA，经过RT—PCR扩增可变区基因，运用两种不同的限制性内切酶分别对纯化的轻链PCR产物和表达载体进行酶切，再对切割产物进行分离纯化，按一定比例将载体和轻链连接，转化感受态细胞并扩大培养，提取质粒即为轻链库。
再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切，纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞并扩大培养，提取质粒既为轻链库。
再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切，纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞，加入辅助噬菌体培养，离心取上清，加入聚乙二醇(PEG)沉淀并收集噬菌体颗粒，这样就得到噬菌体总抗体库。
3 噬菌体抗体库的表达载体和筛选
噬菌体抗体库的表达载体可分为入噬菌体(phage入)、单链丝状噬菌体(filamentous phage)及噬菌粒(phagemid)三种系统，这三种系统各有其利弊。
入噬菌体表达系统可通过菌斑印迹(plaque lift)筛选克隆，但外源性片段不能太大，其库容量较小(106)。
丝状噬菌体主要为Winter实验室所采用，目前已构建了fd CAT1及fd D()Gl，并已制备ScFv；在此载体中又包括单价及多价两个子系统，可筛选出高亲和力抗体。
噬菌粒是应用最多的表达载体，也是简便高效模拟B细胞产生抗体的原核表达系统。
建抗体库的目的是筛选出各种特异性的抗体分子，噬菌体抗体库在这方面有无可比拟的优势。
经典的筛选方法有两种：一是将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；二是将抗体与生物素基团相连，再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。
在筛选过程中，噬菌体种类、固相介质表面的抗原密度或溶液中抗原的浓度和清洗时间三种因素对筛选的效率影响较大。
同时，每一轮筛选都需要进行检测，以证实筛选的有效性。
4 噬菌体抗体库技术的优点
①方法简单易行，节省时间，可通过发酵生产来大量制备；②筛选容量增大，可在数周内筛选100万～ 1亿个克隆，可获得高亲和力的人源化抗体；③直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因，因此可以获得完全人源化的抗体，克服了杂交瘤细胞不稳定的缺点，避开了人工免疫和杂交瘤技术；④模拟体内免疫过程和天然全套抗体库，随意“制造”和克隆针对任何抗原的抗体。
5 结语
不可否认，噬菌体抗体库技术已显示强劲的发展势头，它的价值不仅仅在于抗体的制备，其强大的筛选能力已广泛地应用到免疫学、细胞生物学、药理学、蛋白质工程等诸多领域。
后基因组时代的到来，就是研究蛋白质的结构、功能及其相互作用，噬菌体抗体库技术能提供此项技术平台。
但人们需要进一步解决的问题是构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库使其库容和多样性不下降和新筛选方法的建立。
相信随着此项技术的不断完善，将会有一个广阔的诱人前景.。