第二章 发酵工业菌种

一些微生物的G+C含量 G-C含量（mol%） 50~52 50~53 45.5 64~67 69.5~73 66.5 64~69.5 52.5 51~54.5 29.5
2、核酸分子杂交法
DNA-DNA DNA-rRNA rRNA-rRNA 方法: 待测菌株dsDNA----ssDNA 参照菌株,同位素标记的ssDNA 检测杂合DNA的放射性强度,参照菌 株自身DNA复性的放射性强度为 100%
例：醛肟水解酶的筛选
培养基中含0.05% of Z-PAOx
每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基
不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落
浓度梯度法
产物合成能力与抗自身产物能力有关 有毒物质的降解能力与抗此毒物能力有关
下层加入抗性物质
上层不加入抗性物质
梯度培养皿平板制备
高浓度
1、细胞壁的化学成分 肽尾的第三位氨基酸、肽尾交联 2、全细胞水解液的主要糖型 无糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等 3、磷酸类脂成分的分析 4、枝菌酸的分析 5、醌类分析
（三）数值分类法
统计分类法，生物大量表型性状的相 似形程度进行统计、归类的方法
DNA-DNA杂交同源性性>60%为同种 >70%同一亚种 20～60%为同一属
3、rRNA寡核苷酸编目分析





rRNA是细胞中的“活化石” 原核生物：23s、16s、5s 真核生物：28s、18s、5.8s 16s或18s用作系统分类：（提出三域学说） 生理功能重要又恒定、含量高易提取、核 苷酸序列保守、分子质量适中、信息量大
1、采样对象 以采集土壤为主。 根据微生物营养类型。 根据微生物的生理特性。 极端环境条件下。
采样



2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋 初为好。 3、采土方式： 在选好适当地点后，用小铲子除去表土， 取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁 的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记 录采样时间、地点、环境条件等，以备查 考。为了使土样中微生物的数量和类型尽 少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及 时分离。
三、酵母菌

酵母菌是一类以芽殖或裂殖 进行无性繁殖的单细胞真菌 的总称

酵母菌超过 600 种，分属于 39个属。
主要分布是在含糖量较高的、 偏酸性的环境中； 酵 母 菌 的 最 适 温 度 是 25-30℃； 人类实践中应用较早的微生 物


工业生产中常用的酵母有啤酒酵母、假
丝酵母、类酵母等，分别用于酿酒、制

五、未培养微生物


迄今所采用的微生物纯种培养分离及培 养方法还未获得纯培养的微生物，在自 然界微生物群落中占有非常高的比例 （99%）。 未培养微生物广泛存在于各种极端环境 （高温、低温、高盐、高压、高辐射以 及较强的酸碱环境）中。
第二节 菌种分离
一、菌种的来源

根据资料直接向有科研单位、高等院校、 工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
细菌的形态

细菌的三种主要形态： 球形（球菌） 杆形（杆菌） 螺旋形（螺旋菌）
细胞形态基本保持恒定。



工业生产常用的细菌有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。 用于生产各种酶制剂、有机酸、氨基酸、 肌苷酸等。 细菌常用在基因工程载体的宿主细胞， 用于构建基因工程菌来生产外源物质， 如利用大肠杆菌生产核酸和蛋白质疫苗。
富集方法（enrichement）
物理方法：加热、膜过滤和离心法等
通过定向培养的方法：
1、底物 4、培养温度 2、pH条件 5、抑菌剂 3、培养时间
等一切能提高目的微生物相对生长速度的 手段，培养（固体、液体；分批连续）后 使目的微生物在种群中占优势。
纯种分离

1．稀释分离法 2．平板划线分离法 ⑴ 涂菌： ⑵ 划线分离：

二、分类鉴定中的现代方法
（一）核酸分析鉴定法 （二）细胞化学成分鉴定法 （三）数值分类法

（一）核酸分析鉴定法
1、DNA碱基G+C%比例的测定 2、核酸分子杂交法 3、rRNA寡核苷酸编目分析 4、微生物全基因组序列测 定
1、DNA碱基G+C%比例的测 定

简称GC比 G+C （G+C）%= ——————X100%
二、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤
有针对性地采集样品
采 样
让目的微生物在种群中占优势， 使筛选变得可能。
纯种分离的原则就是使培养物获 得单个菌落。
富 集 培 养 纯 种 分 离 菌落的选择 利用筛选模型，选择具有目的产物合成 能力相对高的菌株
生产性能测定
测定代谢产物或其它目的性状
采样

A+T+G+C
亲缘关系相近的种ＧＣ比也相近 ＧＣ比差别大亲缘关系必然远 种内差距2.5-4.0％, 种间>5%, 属间差距 >10%


测定G+C%一般采用解链温度法Tm Tm高G+C%高
（G+C）% =（Tm-69.3)×2.44
菌种 细菌 大肠杆菌 伤寒沙门氏杆菌 短乳杆菌 铜绿假单胞菌 放线菌 灰色链霉菌 丙酸放线菌 星状诺卡氏菌 霉菌 米曲霉 产黄青霉 大毛霉
造面包、生产脂肪酶以及生产可食用、
药用和饲料用的酵母菌体蛋白等。
四、霉菌


霉菌是丝状真菌的一个俗称，即引起物品霉变 的真菌 通常指那些菌丝体较发达又不产生大型肉质子 实体结构的真菌。
1、青霉（自然分布广，产青霉素 ）
2、曲霉（产酶制剂 ）
3、毛霉
分解蛋白能力强，制腐乳。 糖化能力强，酒精发酵原料的糖化 引起食物腐败。
低浓度
梯度平板上菌落生长情况
第三节 菌种鉴定
细胞水平：形态、运动、营养、生长等 细胞组分水平：细胞壁、抗原性等 蛋白质水平:氨基酸分析、免疫标记等 核酸水平：G+C%、分子杂交、rRNA
鉴定步骤
获得纯培养物 测定一系列必要的鉴定指 标 查找权威性的菌种鉴定手 册

一、经典的鉴定指标
形态、生理、生化反应、 生态特征、生活史、 血清学反应、噬菌体敏感性 最常用、最重要、最方便 也是现代化分类鉴定的依据
菌落直接涂布法 琼脂挖块法 纸片法
菌落的筛选方法——分初筛和复筛


复筛则是精选，以质为主，也就是以精确 度为主。因此在具体方法上就有差异。 一般是将初筛菌株接入液体培养，当目的 产物达到高峰时期，终止培养，用精确的 检测手段，进行目的产物的定量测定。
变色圈法
在底物平板中加入指示剂或显色剂使所需微生物 很快鉴别出来.
第二章 发酵工业菌种
发酵工业菌种概述 发酵工业菌种的分离筛选 发酵工业菌种鉴定 发酵工业菌种改良 发酵工业菌种保藏



第一节发酵工业菌种概述
发酵工业应用的微生物种类很多，可分为两大类：
可培养微生物和未培养微生物。
可培养微生物通常分为四类：细菌、放线菌、酵
母菌和丝状真菌。
一、细菌
以二分裂为主要繁殖方式的单 细胞原核微生物。 细菌是自然界中分布最广、 数量最大、与人类关系极为 密切的一类微生物。
2）含酪蛋白培养基进
行微 生物的培养分离
3）根据水解圈的大小
筛选酶活高的菌株
生长圈法：通常用于分离筛选氨基酸、核
苷酸和维生素等生长因子产生菌。 辅助菌是相对应的营养缺陷型菌株。将待筛菌株涂 布于（纸片）含高浓度的辅助菌并缺少辅助菌所需 营养物的平板上培养，若待筛菌可合成目的产物， 在该菌株周围便可形成一个浑浊的生长圈。

步骤
一批待测菌株核有关典型菌株 要求50个以上的特征，等权，越多越 好 计算两菌株间的相关系数 按相关系数的高低排列成矩阵 将矩阵图转为树状谱
物,使培养基浑浊,能分解底物的微生物便会在菌落 周围形成透明圈。
透明圈法:在平板培养基中加入溶解性较差的底
例. -淀粉酶的筛选
将适当稀释的样品， 涂布在以淀粉为碳源 的培养基上，生长后 可见水解圈，碘染色 后水解圈更清晰可见， 根据圈的大小，选择 菌落。
例、 蛋白酶产生菌的分离
筛选
1） 样品采集
二、放线菌
一类主要呈菌丝状生长和以孢 子繁殖的陆生性较强的原核 生物。 单细胞结构 革兰氏阳性 产生多种物质
放线菌病
放线菌的繁殖
无性孢子（主要）
菌丝片段
分生孢子
孢子囊孢子
横隔分裂
缩缢分裂



放线菌的最大经济价值就在于能产生多 种抗生素。 从微生物中发现的抗生素有60%是放线 菌产生的如链霉素、红霉素、金霉素、 庆大霉素等。 常用的放线菌主要来自链霉菌属、小单 孢菌属和诺卡菌属等。
16S、18S RNA
大肠杆菌16SrRNA 1542个核苷酸，T1RNA酶水解为 550—600个片段 6个核苷酸有22个，均匀分布 工作量大

4、微生物的全基因组序列测定
1990年 人类基因组计划 1995年 流感嗜血杆菌， 第一全测序 2010年 1000种

（二）细胞化学成分鉴定法
设计选择性高的分离方法，才能快速的从环境
或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。

筛选方法也很重要，一定要有很强的选择性和
高灵敏度。
发酵工业对菌种的要求



能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物，易于回收 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌 种改造的可操作性要强 遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上 最好与致病菌无关） 生产特性要符合工艺要求