人类外显子测序技术参数
wes全外显子测序原理
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wes全外显子测序原理WES(全外显子组测序)是一种高通量测序技术,可以高效地检测人类基因组中的所有编码蛋白质的外显子区域。
WES的基本原理是使用特定的引物(半万通量、数百个碱基对)引导DNA聚合酶在DNA模板上扩增外显子区域,并将扩增片段测序获取DNA序列信息。
WES使用两个主要的步骤:DNA片段化和文库制备、测序和数据分析。
DNA片段化是WES过程中的第一步。
在这个步骤中,科学家将DNA切割成小片段,以便将其放入文库中。
这些DNA片段通常是相对较小(100-300bp)的,这样可以提高测序的覆盖率和可靠性。
在该步骤中,使用不同的酶切割,例如剪刀酶,谷氨酰胺酰化酶等。
文库制备、测序和数据分析是WES过程的第二步。
在这个步骤中,科学家将切割好的DNA片段与引物匹配,每个引物匹配一个外显子。
一些引物刻意设计为靠近外显子边缘,以提高捕获的精密度和覆盖率,使测序产生的数据内容更为丰富。
在测序过程中,DNA片段经过PCR扩增和链分析,得到大量的读取长度为50nt-300nt的测序数据。
随后,这些测序数据经过对比分析,人们可以重建出原始DNA的序列,从而识别具体基因并分析其序列。
数据分析可以使用各种软件和工具进行。
相对于基因组测序,WES具有一些优势。
首先,外显子仅占人类基因组的1%-2%,相对于基因组,WES测序时间相对较短。
其次,外显子通常比内含子更加功能性,这些区域通常是与特定疾病相关的。
WES可以检测的区域是与人类疾病之间的关联更加密切。
最后,WES通常是更经济和有效的,因为需要处理的DNA量较小。
但是,WES方法也有一些限制。
首先,WES仅限于已知的外显子和靶区域,对于一些变异位于外显子间区域或非编码序列区域,他们将无法被检测到。
其次,WES在检测某些类型的变异时,如重复序列的扩增,G-富集区域和GC含量高的区域时可能不是非常敏感。
最后,由于WES是针对外显子进行测序的,不能覆盖整个基因。
在一些研究中,必要时,研究人员需要选择其他技术或方法来检测某些特定的基因区域。
wes annovar 注释
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WES (全外显子测序) 是一种高通量的 DNA 测序技术,它可以对整个基因组的外显子区域进行测序。
外显子是真核生物基因组中编码蛋白质的部分,占据了整个基因组的仅1~2,但却包含了大约85的致病突变。
WES 技术可以用来寻找与遗传性疾病、癌症等疾病相关的致病基因突变。
Annovar (Annotate Variation) 是一个用于注释基因组变异的软件工具,它可以快速、高效地对 WES 测序数据进行注释,帮助研究人员理解 DNA 变异的功能和致病性。
本文将针对 WES 和 Annovar 这两个主题展开讨论,首先介绍 WES 技术的原理和应用,然后介绍 Annovar 工具的基本功能和使用方法,最后探讨 WES 和 Annovar 在医学研究和临床诊断中的应用前景。
一、WES 技术的原理和应用WES 技术是一种将高通量测序技术与外显子组关联的方法,主要通过对人类外显子组进行测序,寻找与遗传疾病相关的致病基因。
其具体原理如下:1. 选择性富集外显子区域:WES 技术首先通过靶向捕获外显子 DNA 序列,然后使用高通量测序技术进行测序,从而实现对外显子的高效测序。
2. 高通量测序:WES 技术采用二代测序技术,能够同时对数千个样本进行高通量测序,快速获取大量的 DNA 测序数据。
3. 数据分析和解读:WES 技术得到的外显子测序数据需要经过一系列的生物信息学分析和数据挖掘,以寻找与特定疾病相关的突变位点和致病基因。
WES 技术已经在医学领域得到了广泛的应用,主要包括以下几个方面:a. 遗传病原因的研究:WES 技术可以用来寻找与遗传性疾病相关的致病基因,并帮助研究人员深入理解疾病的发病机制。
b. 肿瘤基因组学研究:WES 技术可以用来寻找肿瘤相关的致病基因和突变位点,从而为癌症的早期诊断和精准治疗提供依据。
c. 个体化医学研究:WES 技术可以帮助研究人员深入理解个体基因组的变异特征,为个体化医学的发展提供重要支持。
全外显子测序的技术要点
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全外显子测序的技术要点全外显子测序是一种高通量测序技术,可以同时测定一个生物体的所有外显子区域的DNA序列。
全外显子测序技术的出现,极大地促进了人类基因组学的发展和疾病研究的进展。
下面将介绍全外显子测序技术的要点。
1. 序列捕获:全外显子测序的第一步是捕获外显子区域的DNA序列。
这一步骤使用特定的引物或探针,使外显子区域的DNA片段与其结合,然后通过化学方法将其他DNA片段去除。
这样可以高效地富集外显子区域的DNA序列。
2. 高通量测序:全外显子测序使用高通量测序技术,如Illumina测序平台。
这种测序技术可以同时测定大量的DNA序列,从而提高测序的速度和效率。
高通量测序技术的出现,使得全外显子测序成为可能。
3. 数据分析:全外显子测序产生的数据量庞大,需要进行复杂的数据分析。
数据分析的主要步骤包括测序质量评估、序列比对、变异检测等。
这些分析可以帮助研究人员鉴定外显子中的遗传变异,从而进一步研究其与疾病的关联。
4. 疾病研究应用:全外显子测序技术在疾病研究中具有广泛的应用价值。
通过对疾病样本和正常样本进行比较,可以发现与疾病相关的遗传变异。
这些变异可能是疾病的致病原因,也可以作为疾病的标志物进行诊断和预后的判断。
5. 个体化医疗:全外显子测序技术为个体化医疗提供了基础。
通过分析患者的外显子序列,可以了解其个体差异和易感基因型。
这对于制定个性化的治疗方案和预防策略非常重要。
6. 遗传咨询:全外显子测序技术的应用还使得遗传咨询工作更加准确和全面。
通过对患者及家族成员的全外显子测序,可以准确地识别携带疾病相关基因突变的个体,为其提供个性化的遗传咨询和风险评估。
7. 数据存储和共享:全外显子测序产生的数据量巨大,对于数据的存储和共享提出了挑战。
科研机构和数据库需要建立完善的数据管理系统,确保数据的安全性和可访问性,以促进全外显子测序数据的广泛应用。
8. 未来发展:随着测序技术的不断发展,全外显子测序技术也将不断改进。
全外显子测序检验的临床意义与样本要求
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全外显子测序检验的临床意义与样本要求在当今医学领域,全外显子测序检验正逐渐成为临床诊断和治疗中不可或缺的重要工具。
全外显子测序是一种高通量的基因组测序技术,能够对所有外显子区域进行全面的检测和分析,从而帮助医生发现患者潜在的遗传变异和突变,为疾病的诊断和治疗提供更精准的信息。
针对全外显子测序检验的临床意义和样本要求,本文将从多个角度进行探讨,并共享个人观点和理解。
一、全外显子测序检验的临床意义1. 诊断和治疗指导:全外显子测序能够为医生提供全面的遗传变异信息,帮助精准诊断疾病类型和确定治疗方案。
尤其对于罕见遗传病、癌症等复杂疾病的诊断和治疗指导具有重要意义。
2. 遗传沟通和家族风险评估:通过全外显子测序检验,可以帮助患者进行遗传沟通,评估患病风险,并为家族成员提供相关遗传信息,帮助他们进行风险评估和健康管理。
3. 个性化医学:全外显子测序检验为个性化医学提供了重要的基础数据,可以根据个体的基因组信息,制定个性化的预防、诊断和治疗方案,实现精准医疗。
二、全外显子测序检验的样本要求1. 样本类型:全外显子测序通常需要采集患者的血液样本,获取其中的DNA进行测序分析。
对于一些特定疾病或研究项目,还可能需要获取肿瘤组织样本等特定样本。
2. 样本质量:样本的质量直接影响着全外显子测序的准确性和可靠性。
在采集和保存样本时,需要注意避免血液凝块和样本污染等情况,保证样本的纯度和完整性。
3. 样本数量:通常情况下,全外显子测序需要一定数量的DNA样本才能进行测序分析。
对于不同的实验项目和测序评台,样本数量的要求可能会有所不同,需要根据具体情况进行调整。
三、个人观点和理解全外显子测序作为一种新型的基因组测序技术,对于临床诊断和治疗具有重要意义。
通过对个体基因组的全面检测,我们能够更好地了解疾病的遗传基础,为精准医学提供数据支持。
然而,在进行全外显子测序检验时,我们也需要考虑样本的要求和质量,以确保测序结果的准确性和可靠性。
外显子组测序信息分析
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外显子组测序信息分析外显子组测序技术的基本步骤包括DNA提取、文库构建、高通量测序和生物信息学分析。
首先,从样品中提取DNA,通常使用血液或组织样本。
然后,将DNA片段切割,并使用特定的引物将其扩增为文库。
接下来,将文库中的DNA片段进行高通量测序,产生大量的短读取序列。
最后,使用生物信息学工具对测序数据进行分析,以寻找变异并解读其意义。
外显子组测序的结果可以提供大量有关基因组的信息。
首先,可以检测SNV和Indel等单个碱基突变,这些突变可能与人类疾病的发生相关。
其次,可以检测到外显子区域的读框错移突变,这些突变可能会导致蛋白质的功能改变。
此外,还可以通过检测外显子区域的拷贝数变异(CNV)来揭示与疾病相关的基因缺失或复制。
最后,外显子组测序还可以帮助发现新的基因和调控元件,以及对个体之间的遗传差异和基因底物关系进行研究。
虽然外显子组测序技术已经取得了很大的成功,但仍然面临一些挑战。
首先,外显子组测序只能揭示外显子区域的变异,而无法揭示基因组的其他部分。
其次,由于测序数据的复杂性,需要进行大量的生物信息学分析,对于没有相关经验的研究者来说可能会有一定的难度。
此外,由于运营和存储测序设备的成本较高,外显子组测序对实验室和研究者的设施和经济资源要求较高。
总之,外显子组测序是一种强大的技术,可以揭示与人类疾病相关的基因变异。
通过对测序数据的分析和解读,可以帮助我们更好地理解基因组的结构和功能,为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
尽管面临一些挑战,随着技术的进步和成本的下降,外显子组测序在个性化医学和遗传学研究中将发挥越来越大的作用。
外显子组测序技术在遗传疾病检测中的应用
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外显子组测序技术在遗传疾病检测中的应用随着遗传学研究的深入,越来越多的遗传疾病得到了解决。
而随着科技的不断进步,人们开发出了越来越多的工具来解决遗传疾病的检测问题。
其中,外显子组测序技术已成为一项非常有效的检测手段,被广泛应用于遗传疾病的检测中。
本文将会对外显子组测序技术在遗传疾病检测中的应用进行探究,旨在为大家更好地了解这一技术。
外显子组测序技术的原理和特点外显子组测序技术(Exome Sequencing)是一种高通量测序技术,能够快速而准确地对人类基因组中存在的编码蛋白的外显子进行测序,包含人类基因组中的大约2%的基因部分,是人类基因组测序的有效手段。
外显子组测序技术是一种基于高通量测序技术的分子生物学技术,是通过将人类基因组中的编码蛋白的外显子与大量的引物反复杂交,在使得这些引物与DNA序列结合的过程中,将其扩增并进行序列测序。
拥有比全基因组测序更高的覆盖度、更快的处理速度以及更低的成本,使得外显子组测序技术成为大规模测序的主流工具之一。
外显子组测序技术不仅可以用于人类基因组的测序,同时也可以用来分析外显子,从而更好地了解人类的基因遗传机制。
外显子组测序技术的应用外显子组测序技术具有高精度和高可靠性的特点,使其在遗传疾病的诊断和基础研究领域中广泛应用。
此外,外显子组测序技术可以通过测序结果,实现遗传疾病的基因诊断和基因分型,探究基因底层的遗传机制,便于更好地分析和解决遗传疾病的治疗问题。
同时,外显子组测序技术还可以用来进行遗传病毒病例筛查、幼儿常见疾病筛查、基础分子遗传学研究、基因功能研究和人群遗传学研究等领域,具有广泛的应用前景。
外显子组测序技术的优缺点虽然外显子组测序技术在遗传疾病检测方面具有很大的优势,但是在实际应用中还存在着一些缺点,需要进行全面评估和优化。
其优点主要表现在以下几个方面:首先,外显子组测序技术可以对大量的外显子序列进行高通量测序。
与以往的Sanger测序方式相比,外显子组测序技术可以大大提高测序效率和速度。
外显子组测序技术
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外显子组测序技术一、前言外显子组测序技术是一种高通量测序技术,它可以通过对人类基因组的外显子进行测序,来寻找与疾病相关的基因变异。
本文将详细介绍外显子组测序技术的原理、方法和应用。
二、原理外显子组测序技术是一种全基因组测序的变体,它只对基因组中编码蛋白质的区域(即外显子)进行测序。
这种技术可以检测到与疾病相关的单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失(indel)和结构变异等多种类型的突变。
三、方法1. 样品准备首先需要从患者或正常人身上提取DNA样品,并将其分离成片段。
然后使用特定的酶来切割这些片段,使其只包含编码蛋白质的区域。
2. 库制备接下来需要将这些片段连接到适当大小的DNA片段上,并添加适当的标签以便于后续处理。
这个过程称为库制备。
3. 测序完成库制备之后,需要进行高通量测序。
当前可用于外显子组测序的技术包括Illumina、Ion Torrent和Pacific Biosciences等。
4. 数据分析测序完成后,需要对数据进行处理和分析。
这个过程可以使用各种软件来完成,例如BWA、GATK和SAMtools等。
四、应用外显子组测序技术已经被广泛应用于疾病研究和临床诊断。
例如,在肿瘤学中,它可以检测到肿瘤细胞中的突变,并帮助医生选择最佳的治疗方案。
此外,它还可以用于遗传性疾病的诊断和预测。
五、优缺点1. 优点外显子组测序技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点。
它可以检测到多种类型的基因变异,并且可以同时对多个样品进行分析。
2. 缺点外显子组测序技术的主要缺点是成本较高,并且需要较长的数据处理时间。
此外,由于只对编码蛋白质区域进行测序,因此无法检测到与非编码RNA相关的突变。
六、总结外显子组测序技术是一种重要的高通量测序技术,它可以用于疾病研究和临床诊断。
虽然它有一些缺点,但随着技术的不断发展,相信它将在未来得到更广泛的应用。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
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外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序(exome sequencing)是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法,其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段,它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域,但却承载着80以上的已知致病突变。
因此,外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变,以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序,然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析,从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比,外显子测序具有较低的成本和更高的效率,因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性,可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变,还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序,我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律,为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而,外显子测序也面临一些挑战。
首先,由于外显子区域相对较小,它只能提供关于外显子的信息,对非编码区域的突变鉴定有限。
其次,外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难,因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外,外显子测序对测序深度和准确性要求较高,因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之,外显子测序作为一种高效、准确的测序技术,在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大,外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系,为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时,对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解,有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
最新外显子组测序数据分析报告
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目录1, 分析流程和目录信息 (2)1.1分析流程图 (2)1.2目录信息 (2)2, 数据的质控(QC目录) (3)2.1数据质量qc图 (3)2.2数据量统计 (6)3, 序列比对(target目录) (7)3.1比对方法 (7)3.2数据比对统计 (7)4, SNV的识别和计算(raw目录) (11)4.1方法简介 (11)4.2 VCF格式说 (14)4.3 SNV和Indel统计信息 (15)5,变异体的注释和统计(result目录) (17)5.1 注释结果统计 (17)5.2 注释结果详细说明 (21)6,候选位点分析结果 (Candidate目录) (25)6.1 位点筛选标准 (25)6.2 候选位点结果说明 (26)7,参考文献和数据库 (27)7.1 分析软件参考文献 (27)7.2 参考数据库 (27)1, 分析流程和目录信息1.1分析流程图1.21. 外显子测序质控结果2. 捕获区域比对数据与覆盖度等指标统计3. SNV和Indel原始VCF文件4. SNV和Indel注释结果及分布统计5. 候选SNV和Indel结果注意:所有txt,stat,VCF等文本文件都可以用excel打开2, 数据的质控(QC目录)2.1数据质量qc图1,每循环的碱基质量分布图2,不同质量的read数量分布图3,read的长度分布图4,碱基N数目分布统计5,每循环ATCG分布统计6,read的GC含量统计7,每循环的GC比例统计2.2数据量统计Summary文件sample pf read clean read Trim remain% pf base(G) clean base(G) Trim remain% 样本名原始read数有效read数有效read比例原始碱基数(G)有效碱基数(G)有效碱基比例lf002 48661241 47997016 98.63500193 9.829570682 9.58777551 97.54012479 lf003 47690482 47045833 98.64826487 9.633477364 9.396330775 97.53830751 lf004 48179592 47522300 98.63574602 9.732277584 9.493069911 97.54212032 lf005 37943779 36984007 97.47054188 7.664643358 7.337483061 95.7315653 lf006 46440756 45615915 98.2238855 9.381032712 9.040112844 96.36585994 lf007 53829583 52838815 98.15943586 10.87357577 10.47063335 96.29429703 lf008 44526129 43527254 97.7566543 8.994278058 8.629876672 95.94851993, 序列比对(target目录)3.1比对方法参考序列在整个处理过程中使用UCSC hg19版本的人类基因组序列作为参考,注释信息和命名法则均已UCSC为标准,相关数据可以从UCSC网站下载。
wes标准
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wes标准WES是什么?WES全称为Whole Exome Sequencing(全外显子测序),是一种高通量基因测序技术,可以快速、高效地测定一个个体的所有外显子基因。
WES的优点1. 全面性:WES可以检测所有外显子基因,涵盖了人体基因的大部分区域,相比之下,传统的基因检测只能检测特定的基因位点。
2. 高效性:WES是一种高通量的基因测序技术,可以在较短的时间内获得大量基因序列数据。
3. 准确性:WES技术在基因测序的准确性上已经得到了很大的提高,对于SNP和Indel的检测准确率已经很高。
4. 适用性:WES适用于不同的研究领域,包括生物医学研究、疾病诊断、个体化医学等。
WES的应用1. 生物医学研究:WES可以用于探索人类遗传基因的变异与疾病发生的关系,帮助人们更好地了解疾病的发生机制,为疾病的治疗提供更好的思路和方法。
2. 疾病诊断:WES可以用于寻找患者疾病的基因突变,尤其是罕见病的诊断,为病人的治疗提供有力的依据。
3. 个体化医学:WES可以对个人的基因信息进行分析,为个体化医疗提供科学的数据支持。
WES的发展趋势1. 增强数据分析的能力:WES产生的大量数据需要进行生物信息学分析,需要开发更高效、更准确的分析算法和软件。
2. 优化高通量测序平台:高通量基因测序平台在产生WES数据方面仍有改进的空间,可以更加精准和高效地测序。
3. 探索未知的生物学问题:随着WES技术的不断发展,可以用来解析更加复杂、不确定的生物学问题,同时也可以应用到更多不同的研究领域。
结语WES技术已经在疾病诊断、生物医学研究和个体化医疗等领域发挥了巨大作用,对于人类健康的研究和保障有着重要的意义。
随着技术的不断成熟和发展,WES将扮演着越来越重要的角色。
外显子组测序

346: 256-259.
[案例三] 癌症研究:外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路,对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变,其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变,76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到,表明对肿瘤的某一区域进行单次活检,以适当的深度对其测序,可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明,肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%,说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]:发现致病基因PIGV; 逆向性痤疮[2]:发现致病基因NCSTN; 眼皮肤白化病[3]:发现致病基因SLC24A5; 先天性肾脏和尿道畸形[4]:发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]:发现致病 基因ANGPTL3; 孤独症[6]:发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
全外显子组检测技术参数要求

附件:全外显子组检测技术参数要求样本量:500个样本一、公司资质:1.拥有先进的高通量二代测序平台和高性能计算平台;2.具有短期处理大量样本,进行全外显子组和全基因组测序的经验;3.实验室具有国内或国外权威机构的资质认证;4.*应标的公司必须通过医学遗传中心选送的样本测试(三个以上生物学重复),并且需交付原始下机数据,以中心提供的标准化流程统一进行质量评估。
二、技术参数:1)污染防控具有独立的实验方法进行样本身份鉴定,可追溯样本间发生的错误2)测序质量1.Q20平均比例在90%以上。
2.Q30平均比例在85%以上。
3.GC content 分布无明显偏移。
3)测序深度、覆盖度统计下文涉及的数据均为经过去接头、比对、排序和去重后的有效数据。
数据统计涉及的相关软件除特别说明外,应使用默认参数。
1.数据质量要求:1)Mapped unique reads相对总reads的比例(PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED)不得低于99%2)有效数据总量(PF_UQ_BASES_ALIGNED)不得低于10G3)On targeted bases相对总bases的比例(PCT_USABLE_BASES_ON_BAIT)不得低于50%4)On and near targeted bases相对总bases的比例(PCT_SELECTED_BASES)不得低于80%5)全外显子碱基10X覆盖率(PCT_TARGET_BASES_10X)不得低于95%6)全外显子碱基30X覆盖率(PCT_TARGET_BASES_30X)不得低于80%7)全外显子组各区域覆盖的一致性统计要求:80%以上的target region的normalizedcoverage值不得低于0.3。
人全外显子测序结题报告
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人全外显子测序结题报告成都生命基线科技有限公司目录一、分析方法 (3)1.1 全外显子组测序 (3)1.2 生物信息分析概述 (3)1.3 数据过滤 (4)1.4 比对 (4)1.5 InDels 附近区域的局部重比对 (4)1.6 碱基质量值校正(BQSR) (4)1.7 变异检测 (5)1.8 过滤变异结果 (5)1.9 变异结果注释与预测 (5)1.10 网络资源 (5)二、项目流程 (6)2.1 实验流程 (6)2.2 信息分析流程 (6)三、项目结果报告 (7)3.1 测序数据产出 (7)3.2 目标区域上的比对结果统计 (8)3.3 数据质控 (10)3.4 SNP结果 (10)3.5 InDel 结果 (11)四、参考文献 (13)五、帮助 (14)5.1 FASTQ格式说明 (14)5.2 比对结果格式说明 (14)5.3 如何实现基因组变异可视化 (15)5.4 如何选择用于验证的变异 (15)5.5 如何寻找候选变异 (15)5.6 交付目录及结果文件说明 (16)5.7 如何解压缩文件 (16)六、常见问题 (17)一、分析方法1.1 全外显子组测序质量合格的基因组 DNA 样品通过超声波高性能样品处理系统(Covaris)随机打断成主峰是 200bp-300bp 左右的片段。
随后进行 DNA 片段末端修复,3’端加上“A”碱基,两端加上文库接头。
接头连接后的文库进行线性扩增(LM- PCR )制备成杂交文库。
取适量的杂交文库与外显子芯片进行捕获富集,洗脱掉未富集的片段后进行扩增。
扩增产物经Agilent 2100 bioanalyzer 仪器(Agilent DNA 1000 Reagents)和 QPCR 质控,质控合格后即可上机测序。
我们使用 Illumina HiSeq 系列平台,对每个合格的文库进行高通量测序,并保证每个样品的数据量达标。
测序得到的原始图像数据,经 Illumina 碱基识别软件(Base Calling)转化为原始序列数据(raw reads),即双末端 reads(paired-end reads),数据以 FASTQ 文件格式存储,称之为 raw data。
全外显子组测序的具体方法及步骤
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全外显子组测序的具体方法及步骤全外显子组测序(Whole Exome Sequencing,简称WES)是一种高通量测序技术,用于测定一个个体的所有外显子区域的DNA序列。
外显子是编码蛋白质的基因组区域,占据了人类基因组的约1-2%。
WES可以用于寻找致病基因突变,特别是在遗传性疾病的分子诊断中有广泛的应用。
下面将详细介绍WES的具体方法及步骤。
1.样品准备:-提取DNA:从待测个体的外周血或组织样品中提取总DNA。
-细胞裂解:使用特定组织裂解缓冲液将细胞或组织样品裂解,释放DNA。
-纯化DNA:通过离心等步骤,去除杂质,纯化DNA。
2.外显子库建立:- 靶向捕获:使用外显子组富集探针(baits)将DNA中的外显子区域进行加权,并去除非外显子区域的DNA片段。
-杂交反应:将靶向探针与DNA样品进行杂交反应,使探针与待测DNA的外显子区域发生特异性结合。
-洗涤:将未结合的探针洗掉,保留结合的外显子区域DNA片段。
-PCR扩增:对靶向捕获得到的DNA片段进行PCR扩增,以增加样品中外显子区域的DNA原料。
3.高通量测序:-数据库构建:将PCR扩增得到的外显子DNA片段建立一个DNA文库,用于测序。
- 测序反应:使用高通量测序平台(如Illumina HiSeq X)进行DNA文库的测序,得到大量的短序列片段(reads)。
- 数据处理:通过对这些reads进行去除低质量序列、比对到参考基因组等处理,获得高质量的测序数据。
4.数据分析:- 变异检测:使用专门的变异检测软件对样品中的变异进行分析,包括单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,简称SNPs)和小片段插入缺失等。
-数据解读:将检测到的变异与公开的数据库进行对比,筛选出可能与疾病相关的变异。
-功能注释:对筛选出的变异进行功能注释,评估其潜在影响,进一步缩小候选基因的范围。
- 候选基因验证:对最终候选基因进行进一步的实验验证,如Sanger测序。
全外显子测序深度计算方法
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全外显子测序深度计算方法全外显子测序(Whole-exome sequencing,WES)是一种高通量测序技术,用于测序人类基因组中所有外显子区域的DNA序列。
由于外显子区域占据人类基因组的1%-2%,而包含大部分与蛋白质编码相关的功能位点,因此WES成为了研究人类遗传变异和疾病致病机理的有力工具。
在进行全外显子测序之前,需要对样品进行DNA库构建。
库构建的首要步骤是DNA片段化,将整个基因组或目标区域的DNA随机打断为约150-200 bp的片段,之后使用外显子富集技术,如环境选择性放大法(capturing)或沉降法(solution hybridization),选择片段中的外显子区域进行富集。
完成DNA库构建后,接下来进行高通量测序。
WES通常采用高通量测序平台,如Illumina HiSeq或NovaSeq等,生成数百万到数十亿条短序列(reads),每条短序列通常为100-150 bp。
测序完成后,需要对测序的reads进行质控和数据处理。
测序数据通常以FASTQ格式存储,包含每条reads的序列信息和对应的质量值。
首先,需要使用质控工具(如FastQC)对测序数据进行质量评估。
如果发现有质量较差的reads,可以使用软件工具(如Trimmomatic)进行过滤和修剪,将低质量的reads从数据集中去除。
同时,还需要移除适配体序列,避免影响后续的分析。
经过质控和数据处理后,接下来进行全外显子测序的深度计算。
全外显子测序的深度是指从目标区域得到的平均测序覆盖度,即每个碱基被测序的平均次数。
深度越高,测序数据的准确性和可靠性就越高。
计算全外显子测序的深度可以使用各种软件和工具。
以下是两种常用的深度计算方法:1.简单计数法:此方法将测序覆盖度定义为每个外显子区域中被覆盖的碱基数目的平均值。
通过统计每个外显子区域中的测序片段数目,可以计算得到测序覆盖度。
2.平均深度法:该方法将测序覆盖度定义为每个外显子区域中被测序的平均次数。
41.ACMG全外显子测序指南.
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ACMG全外显子测序指南摘要:美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)以前为序列突变的解释提供了指导.1在过去十年中,随着高通量测序的出现,测序技术迅速发展。
通过采用和利用下一代测序,临床实验室正在进行基因分型,单基因,基因组,外显子,基因组,转录组和遗传疾病表观遗传学检测的不断增加的遗传检测目录。
由于复杂性增加,基因检测的这种转变伴随着序列解释的新挑战。
在这方面,ACMG于2013年召集了一个由ACMG,分子病理学协会(AMP)和美国病理学家学会的代表组成的工作组,重新审视和修订了序列突变解释的标准和准则。
该组由临床实验室主任和临床医生组成。
本报告代表ACMG,AMP和美国病理学家利益相关者联盟组成的工作组的专家意见。
这些建议主要适用于临床实验室使用的遗传检测的范围,包括基因分型,单基因,panel,外显子和基因组。
本报告建议使用具体的标准术语- “致病性”,“可能致病性”,“不确定性意义”,“可能良性”和“良性”来描述在导致孟德尔病症的基因中鉴定的突变。
此外,该建议描述了基于使用典型类型的突变证据(例如,群体数据,计算数据,功能数据,分离数据)的标准将突变分类为这五个类别的过程。
由于本报告中描述的临床基因检测的分析和解释的复杂性增加,ACMG强烈建议临床分子遗传学检测应在经过临床实验室改进修订批准的实验室进行,结果由相关职业认证的临床分子遗传学家或分子遗传病理学家或同等学科专家进行解释。
关键词:ACMG实验室指导; 临床遗传检测; 解释;报告; 序列变异术语;突变报告前言临床分子实验室正在不断增加检测的新的序列突变,因为在检测患者标本时不断发现大量与基因疾病相关的基因。
虽然一些表型与单个基因相关,但许多与多个基因相关。
我们对任何给定序列突变的临床意义的理解是循序渐进的,其范围从那些几乎肯定是疾病致病性突变到几乎肯定是良性的突变。
虽然以前的美国医学遗传学和基因组学会(ACMG)的建议提供了序列突变的解释类别和解释算法,但是这些建议没有提供定义的术语或详细的突变分类指南.1。
panel全外显子组与全基因组测序的全方位对比
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捕获探针供应商
国外较大的提供杂交捕获探针库的供应商
Agilent SureSelect
Roche NimbleGen
IDT xGen™
Twist Bioscience Human Core Exome
国内
迪赢生物
15
靶向捕获与冗余数据
液相杂交捕获技术流程图
冗余数据的产生
同源序列
目标序列
同源序列干扰
panel大小约1-2M,约占全外显子的1%-2%左右
2
检测范围与测序深度
全基因组测序 全外显子组测序 不孕不育panel
30-40X 100-150X 500X以上
3
检测方案的选择
WGS
WES panel
panel和WES,临床上如何选择?
panel具有更低廉的价格,更高的测序深度 WES具有更广泛的检测范围
表型遗传异质性较高,疾病 复杂,难以区分,需要对大 量基因进行筛查,更适合 WES或WGS。
PMID: 29398702
5
检测方案的选择
神经系统疾病/发育异常类疾病
精子异常导致的男性不育
智力障碍
小儿癫痫
线粒体病
行为异常 遗传代谢病
神经肌肉病
基因数量多达2000个以上,表型异质性高,症 状难以区分,容易误诊,更适合WES/WGS
WGS包含所有碱基,可以检测 CNV和非编码序列 panel可定制检测范围,可以加 入WES不包含的目标区域
WES测序深度还不足以区分真 假基因,深度更高的panel却有 可能做到。
23
安捷伦各版本WES对比
靶标 大小
设计 大小
V8
35.1 Mb 41.6 Mb
测序技术WGS、WES、RNA-Seq、ChIP-seq之间的异同
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测序技术WGS、WES、RNA-Seq、ChIP-seq之间的异同1 基础概念平均测序深度:指定区域内得到的所有碱基数目与该区域的长度的比值,如果是全基因组,就是整个测序的碱基数目除以基因组的大小。
比如人类的基因组大小是3G(30亿个碱基),如果全基因组测序共8.9亿条150bp的reads,那么全基因组范围的平均测序深度就是8.9亿*150/30亿~45X。
覆盖度:指测序获得的序列占整个基因组(或者指定区域)的比例。
由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在,测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖所有的区域,这部分没有获得的区域就称为Gap。
例如一个细菌基因组测序,覆盖度是98 %,那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。
由于我们研究目的不一样,通常我们不需要覆盖到全基因组,所以就有了各种针对性的组学技术,也就是我们需要明白的!2 方法介绍理解了上面的测序深度和覆盖度的概念,我们就可以根据它们来区分WGS,WES,RNA-seq组与ChIP-seq,简单地说就是搞清楚这些组学要测什么,而且测多深即可。
全外显子(Whole-exome sequencing):首先外显子组(Exome)是指真核生物基因组中全部外显子区域的总和,包含了蛋白质合成最直接的信息。
外显子组测序(Exome-seq)是利用设计好的探针试剂盒将坐标已知的全基因组外显子区域的DNA捕捉并富集后,进行高通量测序的基因组分析方法。
对于人类基因组来说,外显子区域大概占到基因组的1%,大概在30M左右。
一般全外显子测序的测序深度为50X~200X,具体深度依研究目的而定,其个体之间的变异小(在VCF文件上记录着少许差异,一点点)。
转录组测序(RNA-seq):首先转录组是指在相同环境(或生理条件)下的在一个细胞、或一群细胞中所能转录出的所有RNA的总和,包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)及非编码RNA。
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一、技术参数
一
基本功能要求
1.1
服务范围:外显子测序
1.2
测序平台:HiSeqX Ten/Nova Seq6000
1.3
技术优势:合作项目1200例以上,成功的临床转化经验,优质的室间质评结果,在高通量、准确性上优势明显,应用效果好
1.4
实.Clean Reads Rate>80%;2. Adapter polluted rate<10%;3.碱基含量分布,AT,GC不分离;4.Dup率<20%;5.捕获特异性>75%;6.基因组比对率>99%;7.基因组比对率>99%,Q30>85%。
4.数据分析内容:数据处理、比对及质控、SNP检测及注释、Indel检测及注、SNP&Indel差异分析、CNV检测及注释、SV检测及注释、融合基因分析、变异全局总览
9.变异全局总览:对检测到的SNP、InDel、SV等变异的分布信息以CIRCOS展示出来,便于对整体情况的掌握及对不同样本显子捕获系统:AgilentV6 60M
2.质量检测:1%的琼脂糖电泳检测DNA样品是否有降解以及杂质;NanoPhotometer®分光光度计检测样品纯度;Qubit® 3.0 Flurometer检测DNA样品浓度。
2.比对及质控:本项目以UCSC hg19参考基因组作为参考序列,利用比对软件BWA(,将过滤后的Clean Reads比对到参考基因组上,得到BAM格式比对结果文件。使用Samtools软件对BAM文件进行排序,只保留序列唯一比对结果,再利用Picard标记比对结果中的Duplication read,同时还利用GATK对InDel周围的序列进行局部重新比对,降低SNP检测假阳性,得到高准确性的用于变异检测的比对结果BAM文件。按照个体或样本的特征将其分类,使同一类别内的个体具有尽可能高的同质性,类别之间具体尽可能高的异质性。代谢物含量数据采用极差法进行归一化处理,对代谢物在不同样本间的积累模式进行聚类分析。
5.SNP&Indel差异分析:针对样品的SNP和InDel的注释信息,进行样品间的差异分析,统计比对样本间共有和特异的SNP个数,并以VENN图的方式展示。
V检测及注释:拷贝数目变异(Copy Number Variant,CNV),也称拷贝数目多态性(CNP),是指与参考序列相比,基因组中1 KB至几MB的DNA片段的变异,包括插入、缺失、扩增及其相互组合衍生出的复杂染色体结构变异。
7.SV检测及注释:染色体结构变异(SV)是基因组变异的重要组成,其主要突变类型有:插入、缺失、倒位等在比对到参考基因组序列的基础上,通过染色体结构变异分析软件BreakSeq检测样品在全目标捕获区域所有潜在的SV位点,并使用ANNOVAR软件对检测到SV进行相应的注释。
8.融合基因分析:融合基因是指两个基因的全部或一部分序列相互融合为一个新的基因的过程,是染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果,通常具有致瘤性,存在于多种疾病中。融合基因可促进疾病的发生和发展,并可作为疾病的分子诊断和治疗靶标。
3.SNP检测及注释:在比对到参考基因组序列的基础上,通过突变分析软件GATK从中提取全基因组中所有的潜在多态性SNP位点,再根据质量值、深度、重复性等因素做进一步的过滤筛选,最终得到高可信度的SNP数据集,并对其进行ANNOVAR注释。
4.Indel检测及注):与SNP一样,通过软件GATK进行InDel变异检测及过滤。
5.项目周期:18天
1.5
样本要求:血液样本≥2mL,EDTA抗凝管收集,液氮速冻,干冰运输
1.6
数据质控:1.数据过滤及质控;2.比对及质控。
1.7
数据分析:
1.数据处理:测序得到的某些原始下机序列,会含有测序接头序列以及低质量序列,为保证后续信息分析的质量,我们对原始序列进行过滤,得到高质量的Clean Reads,再进行后续分析。