漆酶与酚类模式底物的结合及反应活性的理论研究

Vol.35高等学校化学学报No.42014年4月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 776~783 doi:10.7503/cjcu20131287

漆酶与酚类模式底物的结合及

反应活性的理论研究

齐艳兵,朱吉人†,孙尧金,杜　芸†,褚建君,石　婷,赵一雷,王晓雷(上海交通大学微生物代谢国家重点实验室及生命科学技术学院,上海200240)

摘要　通过生物信息学分析㊁分子动力学模拟及量子化学计算,对21种邻对位取代酚类模式底物与漆酶的结合能力以及反应活性进行了探讨.生物信息学结构比对分析发现漆酶的活性口袋含有Asp /Glu206,Asn /His208,Asn264,Gly392和His458等保守的氨基酸残基(氨基酸残基编号以Trametes versicolor 漆酶为例,PDB:1KYA);采用MM⁃GBSA 方法计算了21种酚类模式底物与T.versicolor 漆酶的结合自由能.分子力学计算结果表明,漆酶与底物的结合力主要来自Asp206和Asn264等残基与底物分子形成的分子间氢键,并且Phe265残基和酚类底物的芳香环形成π⁃π相互作用.量子化学计算表明,芳环上取代基的推拉电子效应显著影响协同电子转移的底物去质子化过程,其中推电子能力较强的 NH 2, OH, OCH 3和 CH CHCH 3等基团能够明显增强酚羟基反应活性,而吸电子的 CONH 2和 Cl 则具有相反的效应.

关键词　漆酶;结合力;反应活性;分子力学;量子化学;酚类底物

中图分类号　O641.3 文献标志码　A 收稿日期:2013⁃12⁃27.

基金项目:国家 八六三”计划(批准号:2012AA020403)㊁国家 九七三”计划(批准号:2012CB721005,2013CB966802)㊁国家自然科学基金(批准号:21377085,21303101,31121064,J1210047)㊁教育部新世纪优秀人才(批准号:12⁃0354)㊁高等学校博士学科点专项科研基金(批准号:20100073120062)㊁教育部留学回国人员科研启动基金㊁上海市浦江人才计划(批准号:10PJ1405200)㊁ 东方学者”人才计划(批准号:0900000171)和 上海交通大学⁃上海中学科技创新项目”资助.

联系人简介:赵一雷,男,博士,教授,博士生导师,主要从事生物分子结构计算和动力学研究.E⁃mail:yileizhao@

王晓雷,男,博士后,主要从事氧化还原酶分子机理研究.E⁃mail:thundawner@

†现在上海中学工作.漆酶(苯二酚氧化酶,EC:1.10.3.2)是真菌㊁植物及昆虫中广泛存在的一种多铜氧化酶,可以利用氧气分子作为电子受体氧化多种底物[1].漆酶已被证明可参与木质素的合成和降解等多种生物过程[2~4].并被应用于污染物的处理,特别是对富含酚类的污水和土壤的处理[5,6].相对于过氧化物酶和其它酚类氧化酶,漆酶的优势在于它的电子受体是氧气分子而不是过氧化氢[7,8].

漆酶结构中含有2个活性位点,分别对应电子受体(O 2)和电子给体(底物),两者相距约1.2nm [1].底物结合位点包含一个Ⅰ型铜(T1),而氧气结合位点包含一个Ⅱ型铜(T2)和2个Ⅲ型铜(T3)[9].漆酶协助底物分子上的电子传递到T1铜上,然后通过蛋白质内部残基传递到T2和T3位点,最终将氧气分子还原为水分子[10].常见漆酶底物有多种单体或多聚体酚类㊁苯胺及一些杂环化合物[11].Prasad 等[12]通过分子对接研究了来自Pycnoporus cinnabarinus 的漆酶和苯胺类有毒工业染料的相互作用,发现Arg182,Pro184,Phe185和Asp227等残基对底物的结合起重要作用;Cambria 等[13]通过分子对接及动力学实验比较了2,5⁃二甲基苯胺抑制Rigidoporus lignosus 漆酶和Trametes versicolor 漆酶的分子机制;Galli 等[14]通过突变实验证明了漆酶活性口袋周围的多个苯丙氨酸对体积较大的酚类底物的结合作用.然而,漆酶和底物的结合机制与反应活性之间的关系尚无系统研究.

本文通过构建21种不同取代类型的酚类模式分子,分析代表性的漆酶与底物结合的结构特征,利用分子动力学模拟和量子化学方法,计算了模式底物与漆酶的结合自由能和底物氧化半反应的吉布斯自由能,在此基础上比较不同类型酚类底物的结合特性及反应活性.为认识漆酶催化氧化酚类底物的

分子机理及漆酶介体分子调控效应提供了理论基础.

1　实验部分

1.1　酚类模式小分子BRENDA 数据库中约有110种漆酶底物,其中包含69种酚类底物,可见酚类是漆酶常见的底物,

也可能是其天然底物[15].这些酚类底物的取代基通常为 OH(30种), OCH 3(21种)和 Cl(6种)[图1(A)],还有少量底物含有 NH 2, C(O)NH 2和 CH CHCH 3等基团.其中含有邻位取代Fig.1　Classification of laccase phenol substrates in BRENDA database based on the substituent group (A )and the

position of substituent group (B )的有50种,含有对位取代的有42种,而

含有间位取代的则只有7种[图1(B)].在

邻位取代的底物中,有12种具有2,6⁃邻位

双取代的特征.

本文选择了 OH, OCH 3, Cl, NH 2, C(O)NH 2和

CH CHCH 3等代表性取代基,以邻位取

代㊁2,6⁃邻位取代及对位取代这3种模式来构建模式底物分子(图2);另外还选择了6

种木质素结构小分子类似物16~21[16,17].Fig.2　Modeled 21phenolic substrates based on BRENDA database

1.2　漆酶分子

PDB 数据库中有大约30种不同物种来源的漆酶分子结构.从每个物种中选取一个漆酶作为代表,其PBD 编号分别为1V10,2FQD,2XLL,2YAE,2ZWN,3G5W,3GYR,3KW8,3TA4,3TAS,3V9C,3ZDW,3ZX1,4GXF,4GYB,1HFU,1KYA,2H5U,2HRG,2HZH,2QT6,2XYB,3DIV,3KW7,3PPS,3QPK,3T6V,3V9E,4A2F 和4F7K.然后利用Discovery Studio 3.5软件包中Macromolecules 模块的Align and Superimpose Proteins 功能及PyMOL 软件对这30种漆酶结构进行了序列比对和结构分析[18].采用T.versicolor 漆酶(PDB ID:1KYA)为代表性漆酶结构用于分子力学和量子化学计算.

1.3　结合能计算

根据已确定的漆酶活性口袋特征及关键残基,搭建了漆酶和21种模式底物的复合物结构主要考虑了酚羟基和Asp206的相互作用㊁苯环之间的π⁃π相互作用及氢键受体和供体之间的相互作用等.模式底物分子与漆酶之间的结合能计算采用MM⁃GBSA(Molecular Mechanics Generalized⁃Boltzmann Sur⁃face Area)方法[19]:利用Amber12软件㊁ff03.r1及GAFF 力场[20],在厚度为1nm 的八面体TIP3P 显式水溶剂盒子[21]中对不同模式底物与漆酶的复合物进行经典分子动力学模拟,其中小分子的电荷分布采用AM1⁃BCC 方法,模拟步长为2fs,每种复合物的模拟包含10000步能量最小化,50ps 加热,50ps 777　No.4　齐艳兵等:漆酶与酚类模式底物的结合及反应活性的理论研究